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      生鮮乳中黃曲霉毒素M1 液質(zhì)檢測方法

      2019-08-31 07:36:22左英芳馬超越
      新農(nóng)民 2019年7期
      關(guān)鍵詞:親和柱萃取柱離心管

      左英芳,馬超越,張 昕,張 佳

      (焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心,河南 焦作 454003)

      1 藥物概述

      黃曲霉毒素M1(AFM1)主要由哺乳動(dòng)物食用了發(fā)霉的花生、大豆、玉米等(含有黃曲霉毒素B1)的飼料,并在其體內(nèi)代謝產(chǎn)生。其具有強(qiáng)致突變性、致畸形、致癌性“三致”作用,長期攝入可誘發(fā)肝癌。故各國對乳及乳制品中的AFT M1做了嚴(yán)格的限定。世界多數(shù)采取兩種限量,即0.05μg/kg和0.5μg/kg。中國與美國基本一致,均為0.5μg/kg;歐盟成員國相對較嚴(yán)格為0.05μg/kg,歐盟對特殊膳食用品則限量0.025μg/kg。

      2 黃曲霉毒素M1的檢測方法

      2.1 原理

      試樣中的AFM1和13C17-AFM1用乙腈提取后離心氮吹,經(jīng)Bond Elut Plexa固相萃取柱凈化和富集,凈化液濃縮、定容和過濾后經(jīng)液相色譜分離,串聯(lián)質(zhì)譜檢測,同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

      2.2 實(shí)驗(yàn)材料

      2.2.1 試劑及溶液:甲醇、乙腈為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為滿足國家規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室一級水;正己烷、丙酮、二氯甲烷為分析純。

      2.2.2 AFM1標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥98%,或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。13C17-AFM1同位素溶液:0.5μg/ml。

      2.2.3 儀器設(shè)備:天平:感量0.001g和0.00001g;離心機(jī)(德國Sigma),HY-3多功能振蕩器(江蘇金壇);固相萃取裝置;氮吹儀;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;一次性微孔濾頭:0.22μm微孔濾膜;Bond Elut Plexa固相萃取柱3ml/60mg。

      2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

      2.3.1 提取:稱取5g混合均勻的試樣(精確到0.001g)于50ml離心管中,加入100μL13C17-AFM1內(nèi)標(biāo)溶液(10ng/ml),加入15ml乙腈,渦旋振蕩10min。14000r/min離心5min,取上清液10ml于離心管中,置于50℃水浴中吹至2ml以下,待凈化。

      2.3.2 凈化:依次用3.5ml甲醇、3.5ml水活化Bond Elut Plexa固相萃取柱。上樣,加3.5ml水淋洗,抽干,加3.5ml正己烷淋洗(除脂),抽干。用20%丙酮二氯甲烷溶液4ml洗脫,收集洗脫液于離心管中。

      2.3.3 復(fù)溶:洗脫液于50℃水浴下用氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉?0%乙腈溶液0.5ml溶解,渦旋混勻,取上清液過0.22μm濾膜,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,內(nèi)標(biāo)法定量。

      2.4 液相及質(zhì)譜條件

      2.4.1 液相色譜條件:液相色譜柱:Acquity UPLC BEHC18(1.7μm,2.1mm×50mm)。柱溫:35℃。流動(dòng)相:A:乙腈;B:水。進(jìn)樣量:5μl。

      梯度洗脫如下:

      時(shí)間(min) 流速(ml/min) A% B% 曲線類型/0.3 10 90 /3.00 0.3 35 65 6 4.00 0.3 90 10 6 5.00 0.3 10 90 1

      2.4.2 質(zhì)譜參考條件:毛細(xì)管電壓:3.00 kV;萃取補(bǔ)償電壓:44V;源溫:150℃;霧化溫度:450℃;霧化氣流速:1000 L/hr。

      質(zhì)譜參數(shù)如下:

      藥物名稱 離子源 定性離子對(m/z)定量離子對(m/z)錐孔電壓(V)碰撞能量(eV)AFM1 ESI+329.09>229.13 329.09>259.00 329.09>273.11 329.09>229.13 48 38 20 13C17- AFM1 ESI+ 346.20>288.21 346.20>272.93 346.20>272.93 16 2224

      3 特點(diǎn)對比

      本實(shí)驗(yàn)采用了Bond Elut Plexa固相萃取柱替代免疫親和柱,現(xiàn)就兩種方法的優(yōu)劣進(jìn)行比較如下:

      (1)提取溶劑由國標(biāo)的甲醇改變?yōu)橐译?。過柱液體也由國標(biāo)的40ml變?yōu)楝F(xiàn)在的3ml,極大的節(jié)約了過柱的時(shí)間成本。

      (2)免疫親和柱的儲存條件要求在4℃的條件下冷藏保存,相對只需常溫保存的固相萃取柱而言條件十分苛刻。且免疫親和柱的成本極高,改變條件后極大的節(jié)約了樣品的檢測成本。

      (3)凈化液類型上增加了正己烷和20%丙酮-二氯甲烷,由于該兩種物質(zhì)有較強(qiáng)的毒副作用和環(huán)境污染,故要求實(shí)驗(yàn)人員做好相應(yīng)的保護(hù)措施和廢液處理措施。

      (4)免疫親和柱的選擇性較高,在色譜圖的響應(yīng)高。Bond Elut Plexa固相萃取選擇性低,在色譜圖的響應(yīng)較低,但可以滿足國標(biāo)上的檢測定量要求。

      4 總結(jié)

      本實(shí)驗(yàn)方法是基于實(shí)驗(yàn)室有大批量樣品時(shí),為盡快處理樣品并節(jié)約檢測成本的情況下,進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)方法改善。本實(shí)驗(yàn)方法也有選擇性低、響應(yīng)性低等不足之處,在今后的實(shí)驗(yàn)過程中希望完善不足之處。

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