E26轉(zhuǎn)化特異性同源因子EHF/ESE3在腫瘤中的研究進展*

劉靜 郝繼輝

E26 轉(zhuǎn)化特異性同源因子［ETS（E26 transformation-specific）homologous factor，EHF］，又稱為上皮特異性轉(zhuǎn)化因子3（epithelium-specific ETS factor family member 3，ESE3）屬于ETS 超家族的ESE（epitheliumspecific ETS transcription factor）亞家族，廣泛存在于細胞核內(nèi)，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠單獨或與其他效應(yīng)分子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物增強或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，對細胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡、衰老起到重要的調(diào)節(jié)作用［1］。近年來，多項研究表明EHF作為轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及免疫微環(huán)境調(diào)控中扮演重要角色，具有一定的臨床轉(zhuǎn)化價值。因此，本文針對EHF 在腫瘤實質(zhì)以及免疫微環(huán)境中的功能及機制進行綜述。

1 EHF概述

EHF/ESE3 位 于 染 色 體11p13，分 為ESE3a、ESE3b 和ESE3j 三個亞型。ESE3a 編碼277 個氨基酸，32 kDa；ESE-3b編碼300個氨基酸，35 kDa；ESE3j編碼322 個氨基酸，37 kDa。EHF 主要依賴于其ETS結(jié)構(gòu)域及PNT結(jié)構(gòu)域發(fā)揮功能。ETS結(jié)構(gòu)域有85個氨基酸，形成翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的DNA結(jié)合基序，該區(qū)域通過與靶基因啟動子區(qū)特異性結(jié)合調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，引發(fā)細胞生物學(xué)功能改變［2］。EHF一般結(jié)合于啟動子區(qū)5′-GGAA/T-3′對下游基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但當其與其他轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用時，也可結(jié)合于非經(jīng)典基序，如5′-GGAG-3′［2］。PNT 結(jié)構(gòu)域包含80個氨基酸，位于N末端，其主要作用是介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、激酶對接、RNA結(jié)合、脂質(zhì)分子相互作用以及轉(zhuǎn)錄激活［3-4］。

2 EHF在腫瘤實質(zhì)中的作用

目前針對EHF研究較多的腫瘤是前列腺癌及胰腺癌，均為抑癌基因；EHF 在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用不盡相同，對于同一個信號通路在不同的癌腫背景下甚至發(fā)揮相反的作用。表1 總結(jié)了EHF 在不同腫瘤中的作用及影響的信號通路機制。EHF 在不同腫瘤中的作用差異原因尚不明確，其可能原因有以下幾點：ETS家族轉(zhuǎn)錄因子作用的發(fā)揮受RAS/MAPK信號通路狀態(tài)的影響［3］。ETS 家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（ETS-binding-sit，EBS）附近常伴有AP1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點［3，5］。AP1表達水平升高能夠使EHF與EBS的結(jié)合能力降低至原1/20；AP1 敲除后，EHF 與EBS結(jié)合變得緊密［5］。EBS 核心序列GGAA 前方的一個單核苷酸具有多態(tài)性，能決定EBS與ETS家族不同轉(zhuǎn)錄因子的親和力，如將SCI1 基因的啟動子區(qū)核心序列GGAA 前方核苷酸C 改變?yōu)锳 將引起ERG 與DNA的結(jié)合能力下降8 倍，EHF 與DNA 結(jié)合能力下降1.9 倍［5］。

2.1 EHF與前列腺癌

EHF 為前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要抑癌基因，在抑制前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干性維持、增殖以及化療耐藥等方面均發(fā)揮重要作用。Albino等［6］發(fā)現(xiàn)在前列腺癌發(fā)生早期即可出現(xiàn)EHF 表達降低。對永生化的正常前列腺上皮細胞系PrECs 進行EHF 基因敲除后，細胞將發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細胞運動能力、懸浮成球能力以及對失巢凋亡的抵抗能力均顯著增加。在抑制前列腺癌干性表型方面，EHF可直接轉(zhuǎn)錄抑制經(jīng)典干性調(diào)控分子TWIST1、ZEB2、POU5F1/OCT4、Nanog、BMI1 等。IL-6 為一種重要的促癌因子，不僅能夠通過激活JAK-STAT3 通路促進腫瘤干性表型，也是誘導(dǎo)MDSC及Treg聚集的重要免疫微環(huán)境調(diào)控因子。EHF能夠直接結(jié)合于IL-6這一重要促癌因子的啟動子區(qū)抑制其轉(zhuǎn)錄，抑制STAT3磷酸化，抑制干性表型［7］。同時，EHF 是Lin28/let-7雙向負反饋環(huán)路中的關(guān)鍵分子。let-7 miRNAs 是經(jīng)典的抑癌基因，Lin28 具有抑制let-7 miRNAs 成熟的作用。EHF 在下調(diào)Lin28 的同時，還能直接作用于let-7啟動子區(qū)上調(diào)其表達，而上調(diào)的let-7又可以作用于Lin28 的3′UTR 區(qū)域使Lin28 表達下調(diào)［8］。在影響前列腺癌細胞凋亡方面，Cangemi 等［9］發(fā)現(xiàn)EHF 能夠直接結(jié)合于Caspase3的啟動子區(qū)上調(diào)其表達水平，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。同時，該研究指出EHF 的表達水平受甲基化影響，給予地西他濱處理后，前列腺癌細胞EHF 表達水平顯著升高［9］。在化療耐藥方面，EHF 缺失是前列腺癌紫杉醇化療耐藥的原因之一。EHF可直接轉(zhuǎn)錄抑制神經(jīng)元特異性蛋白DCDC2的表達，而DCDC2 可以與α-tubulin 發(fā)生相互作用引起紫杉醇化療耐藥。因此，EHF 缺失有望成為前列腺癌紫杉醇化療耐藥的預(yù)測因素，在前列腺癌中聯(lián)合升高EHF的治療方案有望逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥［10］。

表1 EHF在不同腫瘤中的作用及靶點

除了對執(zhí)行分子進行直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控進而發(fā)揮抑癌作用之外，EHF 可通過影響泛素化及甲基化過程中的關(guān)鍵分子來發(fā)揮作用。Dallavalle 等［8］研究發(fā)現(xiàn)EHF 促進重要癌基因泛素化降解進程。COP1 為E3泛素連接酶，其高表達能夠促進STAT3、ETV1 和c-JUN 泛 素 化，miRNA-424 能 夠 作 用 于COP1 的3′-UTR 抑制COP1翻譯。EHF 能夠結(jié)合于MIR424的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄抑制miRNA-424表達，進而引起COP1表達升高，促進STAT3、ETV1 和c-JUN 蛋白的泛素化，發(fā)揮了重要的抑癌作用。Kunderfranco 等［11］研究發(fā)現(xiàn)EHF 抑制抑癌基因甲基化沉默過程。EZH2 通過對組蛋白3第27位賴氨酸的三甲基化使得染色體結(jié)構(gòu)凝集，從而實現(xiàn)對相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。EZH2在多種腫瘤中表達上調(diào)，而EHF 能夠直接結(jié)合于EZH2 的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄抑制EZH2 表達，上調(diào)抑癌基因Nkx3.1，抑制前列腺癌發(fā)生發(fā)展。

2.2 EHF與消化系統(tǒng)腫瘤

本課題組針對EHF在胰腺癌中的作用開展了系列性研究，首次發(fā)現(xiàn)EHF 為胰腺癌的重要抑癌基因。對胰腺癌癌與癌旁組織配對組織芯片進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)胰腺癌EHF 表達水平顯著低于癌旁組織，且EHF表達與組織學(xué)分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及脈管癌栓具有負相關(guān)關(guān)系。EHF低表達為較短OS和較短RFS 的獨立危險因素。EHF 能夠抑制胰腺癌的侵襲遷移能力，其主要機制在于EHF 能夠直接結(jié)合于E-cadherin 的啟動子區(qū)，上調(diào)其表達，從而抑制胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程，抑制轉(zhuǎn)移［12］。在乏氧以及低糖環(huán)境中胰腺癌EHF 下調(diào)［13］。在食管癌中，EHF 為抑癌基因，其在正常食管組織和食管癌中的分布位置不同。在正常食管組織中，EHF位于細胞核；而食管癌雖有EHF 表達但位于胞質(zhì)。體外實驗表明，在食管癌細胞系中轉(zhuǎn)染EHF 使其過表達后，EHF 入核也相對增多，進而食管癌細胞增殖能力及侵襲遷移能力均顯著減弱［14］。在結(jié)腸癌中，EHF 在多數(shù)研究中為抑癌基因。Lim 等［15］研究表明EHF 能夠結(jié)合于死亡受體5（death receptor 5，DR-5）基因的啟動子區(qū)上調(diào)其表達促進細胞凋亡。聶娜等［16］采用免疫組織化學(xué)法檢測76例結(jié)腸癌癌組織與癌旁配對組織標本的EHF 表達水平，結(jié)果表明EHF 在癌旁組織中的表達明顯高于相應(yīng)結(jié)腸癌組織，且EHF 低表達或缺失提示較差的病理分期及分化程度。該研究者通過體外實驗證實EHF抑制結(jié)腸癌細胞增殖能力及克隆形成能力，并指出EHF 為結(jié)腸癌抑癌基因［17］。但有研究表明，EHF 能夠上調(diào)RUVBL1 的表達，進而抑制P53的表達及P53誘導(dǎo)的細胞凋亡［18］。

在口腔鱗狀細胞癌中，EHF 為一重要促癌基因，其能夠結(jié)合于角蛋白16 的DNA 啟動子區(qū)促進其轉(zhuǎn)錄，角蛋白16能夠促進β5-整聯(lián)蛋白和c-Met的穩(wěn)定性并激活Src/STAT3信號［19］。在胃癌中，EHF 表達較正常胃組織明顯增加，其高表達與患者的惡性預(yù)后密切相關(guān)。體外實驗也證實，在胃癌細胞中敲低EHF 后，細胞的克隆形成能力以及侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著減弱，細胞周期阻滯，增殖能力下降，凋亡增加。機制上，EHF 能夠與HER2 啟動子區(qū)結(jié)合促進其轉(zhuǎn)錄，并激活MAPK/Erk 及PI3K/Akt 通路［20］。徐勇超等［21］通過體內(nèi)外實驗研究表明EHF在胃癌細胞株中高表達，下調(diào)EHF表達水平后，胃癌細胞的增殖及侵襲遷移能力均顯著受到抑制。此外，胃癌細胞EHF高表達能夠引起其對5-氟尿嘧啶產(chǎn)生化療耐藥［22］。靶向EHF的治療有可能成為胃癌治療以及逆轉(zhuǎn)5-氟尿嘧啶耐藥的潛在靶點。

2.3 EHF與卵巢癌

EHF 在卵巢癌中為一癌基因，癌組織中EHF 表達顯著高于癌旁。EHF 高表達可以激活A(yù)KT 通路，使CyclinD1和p21表達水平顯著增高，細胞增殖速度加快；同時，EHF高表達激活ERK通路，引起ICAM及MMP2 表達水平增高，細胞侵襲遷移能力增加［23］。Brenne 等［24］對卵巢癌腹水瘤細胞及惡性間皮細胞瘤腹水瘤細胞的EHF表達水平進行了QPCR檢測，發(fā)現(xiàn)卵巢癌腹水瘤細胞EHF的mRNA 水平顯著高于惡性間皮細胞瘤腹水瘤細胞，并指出卵巢癌中EHF 高表達是預(yù)后較差的獨立危險因素。

2.4 EHF與頭頸及乳腺腫瘤

在甲狀腺癌及乳腺癌中，EHF 為癌基因。在甲狀腺癌組織中，EHF 表達顯著高于正常組織。體內(nèi)外實驗表明，EHF 促進甲狀腺癌增殖、侵襲、遷移等惡性表型并抑制腫瘤凋亡；其機制在于，EHF能夠結(jié)合于HER2 與HER3 基因的啟動子區(qū)促進其表達，并激 活PI3K/Akt 和MAPK/Erk 通 路［25］。Novoplansky等［26］研究發(fā)現(xiàn)EHF是引發(fā)頭頸部鱗癌西妥昔單抗治療誘導(dǎo)性HER2 及HER3 上調(diào)的關(guān)鍵分子。腫瘤細胞在接受西妥昔單抗治療后出現(xiàn)HER2 及HER3 的上調(diào)，引起靶向治療耐藥；但敲除EHF 后，給予西妥昔單抗治療不再誘發(fā)HER2 及HER3 上調(diào)，提示在西妥昔單抗治療同時抑制EHF有望減少西妥昔單抗治療耐藥的產(chǎn)生。Galang 等［27］采用小鼠乳腺癌移植瘤模型，對正常小鼠乳腺組織與小鼠乳腺癌組織進行QPCR檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠乳腺癌組織中EHF的表達高于正常乳腺組織。He等［28］對10種常見乳腺癌細胞系、2 種永生化乳腺正常上皮細胞系以及一種原代乳腺上皮細胞針對ETS家族基因表達水平進行了Q-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)與正常細胞相比乳腺癌細胞EHF 表達水平顯著升高。

3 EHF與免疫微環(huán)境

本課題組最新研究［29］發(fā)現(xiàn)EHF對胰腺癌免疫微環(huán)境狀態(tài)具有重要的調(diào)控作用。通過回顧性研究人胰腺癌組織標本96例以及前瞻性收集人胰腺癌新鮮組織標本45例，發(fā)現(xiàn)EHF與Treg、MDSCs的聚集水平呈顯著負相關(guān)，與CD8+T 細胞的聚集呈顯著正相關(guān)。其機制在于EHF能夠直接結(jié)合于重要免疫抑制因子TGFβ1以及GM-CSF基因的啟動子區(qū)抑制其轉(zhuǎn)錄，進而抑制Treg細胞以及MDSC的誘導(dǎo)、增殖以及免疫抑制能力。EHF 是一個潛在的胰腺癌免疫微環(huán)境狀態(tài)的評估指標，其表達水平有望指導(dǎo)胰腺癌免疫精準治療方案選擇；即對于胰腺癌EHF 高表達人群適宜給與單藥抗PD-1治療；而對于EHF缺失的胰腺癌患者可能適于Treg、MDSCs 清除方案聯(lián)合抗PD-1 治療［29］。王翔等［30］采用Transwell 小室對結(jié)腸癌細胞以及結(jié)腸癌過表達EHF的細胞分別與樹突細胞進行間接式共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌過表達EHF 的腫瘤細胞能夠促進樹突細胞分化成熟。在肺上皮細胞中EHF能夠抑制DDAH1表達從而促進肺上皮損傷后的炎癥反應(yīng)；同時，EHF 敲除后ITGA2，S100A8、S100A9、MMP表達下調(diào)引起免疫微環(huán)境改變，損傷修復(fù)延遲［31-33］。在肺癌細胞中，EHF 敲除引起CXCL6 和CXCL8 的表達升高，促進中性粒細胞的聚集［31］。

EHF上調(diào)黏膜免疫過程關(guān)鍵基因HCK及跨膜受體CD300LF，促進胞吞過程［34］。在肥大細胞中，EHF介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)過程。肥大細胞表面主要標記分子為高親和力IgE Fc 受體FcεRI 以及干細胞因子受體c-Kit。FcεRI由1個α亞基，1個β亞基和2個γ亞基組成，EHF 能夠直接轉(zhuǎn)錄抑制α 亞基編碼基因Fcer1a，以及β 亞基編碼基因Ms4a2，進而抑制FcεRI 生成；EHF也能直接轉(zhuǎn)錄抑制c-Kit，抑制肥大細胞的作用，進而改變免疫微環(huán)境狀態(tài)［35］。EHF 在成熟的樹突細胞中高表達，為樹突細胞成熟的標記之一［36-37］。EHF 的啟動子區(qū)存在多個PPARγ 結(jié)合位點，加入PPARγ 受體激動劑，如曲格列酮、羅格列酮、吡格列酮等均可以轉(zhuǎn)錄激活EHF 的表達誘導(dǎo)樹突細胞成熟［37］。因此，針對EHF 的治療不僅能夠?qū)δ[瘤的實質(zhì)產(chǎn)生作用，也對免疫微環(huán)境的調(diào)控具有重要影響。

4 總結(jié)與展望

綜上，EHF 為ETS 家族的轉(zhuǎn)錄因子，盡管與其他ETS 家族轉(zhuǎn)錄因子同樣結(jié)合于靶基因啟動子區(qū)5′-GGAA/T-3′位點，但常發(fā)揮其他ETS家族轉(zhuǎn)錄因子相反的作用。EHF 在前列腺癌以及胰腺癌中的抑癌作用較為明確，有望成為臨床預(yù)后判斷以及免疫治療的重要分子標記。EHF 在不同的腫瘤中發(fā)揮作用不盡相同，需要建立基因敲除鼠模型對其功能進行進一步探究。PPARγ 受體激動劑、組蛋白脫乙?；敢种苿┮约癉NA甲基轉(zhuǎn)移酶等均能夠上調(diào)EHF的表達水平，有望成為臨床針對EHF 表達進行臨床轉(zhuǎn)化的方向。