張自陽，王智煜，王 斌，王志偉，朱啟迪，霍云風，茹振鋼，劉明久

(河南科技學院，河南省現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

春季凍害是我國黃淮冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)小麥生產(chǎn)的主要氣象災害之一。近年來，黃淮麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)多次發(fā)生倒春寒，造成河南省中東部、江蘇省北部、安徽省北部和陜西省關(guān)中等地部分品種出現(xiàn)穗部變形、缺粒、頂部不育等現(xiàn)象，導致小麥大面積減產(chǎn)。黃淮麥區(qū)近年來種植品種類型發(fā)生變化，從冬性品種逐漸往晚熟高產(chǎn)的偏春性品種轉(zhuǎn)移，種植結(jié)構(gòu)的改變加大了小麥遭受春季低溫凍害的風險[1-2]。

研究表明，小麥抗寒性與植物細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護酶系統(tǒng)關(guān)系密切。低溫脅迫可使生物體的正常代謝遭到破壞，相關(guān)功能發(fā)生紊亂，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)大量積累，導致細胞液濃度提高，細胞冰點降低，從而增強機體的耐寒性[3-4]。同時，低溫脅迫下植物的正常生理代謝失去平衡，體內(nèi)積累大量的活性氧自由基，而逆境下活性氧清除系統(tǒng)又表現(xiàn)出相對較弱的清除能力，最終導致植株受害。植物體在長期的進化中形成了比較系統(tǒng)完善的活性氧清除酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT等)，能防止植物體質(zhì)膜受到傷害，研究表明，抗氧化酶活性的變化可作為植物抗寒性鑒定的生理指標[5]。

小麥的耐寒機制是一個復雜的生理過程，前人對苗期和越冬期小麥抗寒性研究較多，且大多側(cè)重于一個生長發(fā)育時期，對小麥春季低溫脅迫的研究也僅僅集中在低溫脅迫下葉片抗寒相關(guān)的生理生化方面，鮮有結(jié)合幼穗分化階段對春季低溫脅迫下小麥幼穗抗寒生理機理的研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，春季低溫脅迫主要影響小麥的幼穗發(fā)育和結(jié)實性。因此，本試驗以春季低溫敏感和不敏感的2個小麥品種為材料，采用盆栽和人工模擬春季低溫(倒春寒)脅迫的方法，研究小麥雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期和四分體形成期低溫脅迫下小麥的結(jié)實特性與幼穗生理指標變化，分析抗倒春寒能力不同的小麥品種對低溫脅迫的生理響應機制，為小麥抗倒春寒研究和品種改良提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為前期篩選出的抗倒春寒小麥品種矮抗58和不抗倒春寒小麥品種鄭麥366，均由河南省雜交小麥工程中心提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017-2018年在河南省新鄉(xiāng)市河南科技學院試驗田進行。采用盆栽方法種植，盆栽土取大田耕層0～25 cm深處土壤，土壤平均堿解氮含量62.1 mg/kg ，速效磷含量11.1 mg/kg，速效鉀含量132.5 mg/kg，有機質(zhì)含量26.5 g/kg。盆直徑22 cm，高25 cm，每盆裝土8 kg，在盆底部鉆3個小孔，保證盆內(nèi)土壤與大田土壤的溫度一致，水分和空氣流通。將盆埋入大田后，盆內(nèi)土壤與盆外大田齊平。土壤用水澆透沉實后于10月10日播種。2個品種分別設(shè)對照和低溫處理2組，每組45盆。另外各播種10盆用于取樣鏡檢跟蹤幼穗發(fā)育進程，按照崔金梅等[6]的方法進行。

1.3 低溫處理方法

從2018年3月1日開始，每隔2 d選取主莖和分蘗，調(diào)查矮抗58、鄭麥366幼穗發(fā)育進程，2個小麥品種發(fā)育到穎片原基分化期后，將材料移至人工氣候室中生長(氣候室設(shè)置溫度為白天22 ℃、夜晚13 ℃)。待小麥生長發(fā)育至雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期、四分體形成期后，分別將15盆材料移入人工氣候箱中(人工氣候箱設(shè)置：白天溫度0 ℃，濕度為70%，時間12 h，光照強度30 000 lx；夜晚溫度0℃，濕度70%，時間12 h，光照強度0 lx)處理24，48，72 h。以人工氣候室中不處理盆栽為對照。處理結(jié)束后，將處理的材料分為兩部分，一部分移至人工氣候室繼續(xù)生長，用于調(diào)查結(jié)實情況；另一部分取幼穗用于生理指標測定，將幼穗樣品在冰盒上剪成小段，按0.5 g分裝于凍存管中，迅速用液氮冷凍，于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 抗氧化酶活性及可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、MDA含量的測定

采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性，氮藍四唑(NBT)光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，過氧化氫還原法測定過氧化氫酶(CAT)活性，硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛(MDA)含量。生理指標的測定均采用蘇州科銘生物科技有限公司試劑盒進行。

1.5 穗粒數(shù)測定

待處理過后移至人工氣候室的對照和處理小麥生長至成熟期，調(diào)查單穗結(jié)實粒數(shù)，每處理隨機調(diào)查50穗的結(jié)實粒數(shù)，求平均單穗穗粒數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理及作圖，使用SAS V8分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對參試材料幼穗結(jié)實性的影響

矮抗58和鄭麥366幼穗發(fā)育進程鑒定結(jié)果見圖1，其中雌雄蕊原基分化期低溫脅迫處理72 h 2個品種的結(jié)實情況見圖2。由表1 可知，2個小麥品種在低溫脅迫后，隨處理時間的延長，穗粒數(shù)均降低，且差異達到顯著水平，但不同處理時間、不同品種間穗粒數(shù)降低幅度不同。其中，矮抗58在雌雄蕊原基分化期低溫脅迫處理24，48，72 h后，穗粒數(shù)分別下降了6.52%，14.07%，22.37%，鄭麥366則分別下降了37.14%，44.43%，64.71%；藥隔分化期低溫處理后，矮抗58穗粒數(shù)分別下降了3.74%，9.05%，13.71%，鄭麥366分別下降了27.54%，37.80%，48.55%；四分體形成期低溫處理后，矮抗58穗粒數(shù)分別下降了2.70%，4.70%，4.73%，鄭麥366分別下降了12.39%，29.67%，32.30%。

隨幼穗發(fā)育時期的延遲，同一低溫處理時間下，2個參試材料穗粒數(shù)的降幅均表現(xiàn)下降趨勢。說明雌雄蕊原基分化期對低溫較敏感，此時期低溫對穗粒數(shù)的影響更嚴重。同時，在3個低溫處理時間、3個發(fā)育階段，矮抗58的穗粒數(shù)均高于鄭麥366，說明低溫脅迫對鄭麥366的影響大于矮抗58。

2.2 低溫脅迫對參試材料幼穗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3可知， 低溫處理后，2個小麥品種幼穗的可溶性蛋白質(zhì)含量在雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期和四分體形成期均顯著高于對照。雌雄蕊原基分化期和藥隔分化期均呈緩慢上升-迅速上升-緩慢下降的趨勢，在四分體形成期可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)連續(xù)上升的趨勢。

雌雄蕊原基分化期，矮抗58和鄭麥366可溶性蛋白質(zhì)含量在低溫脅迫的24 h達到最大值，矮抗58較對照增加了116.67%，鄭麥366較對照增加了103.78%；2個小麥品種幼穗在低溫處理的24～72 h，可溶性蛋白質(zhì)含量稍有下降，矮抗58下降幅度小于鄭麥366(圖3-A)。藥隔分化期，低溫處理下矮抗58與鄭麥366幼穗中可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)最大增幅的時間不同，二者分別在低溫處理的24，48 h達到最大值(圖3-B)。四分體形成期，2個小麥品種可溶性蛋白質(zhì)含量在0～24 h呈現(xiàn)連續(xù)快速上升的趨勢，24 h后上升趨于平緩(圖3-C)。

T.上部發(fā)育小花；M.中部發(fā)育小花；L.下部發(fā)育小花；YJ.雌雄蕊原基分化期；YG.藥隔分化期；SF.四分體形成期。T.Upper floret; M.The central flower; L.Lower floret;YJ.Stamens and pistils differentiation stage; YG.Anther separation stage; SF.Tetrad stage.

1.矮抗58對照；1-1.矮抗58低溫處理；2.鄭麥366對照；2-1,2-2,2-3.鄭麥366低溫處理。1.Aikang 58 control; 1-1.Aikang 58 low temperature treatment;2.Zhengmai 366 control;2-1,2-2,2-3.Zhengmai 366 low temperature treatment.

低溫處理時期Low temperature treatment period品種Variety對照(0 h)Control(0 h)低溫處理(24 h)Low temperature treatment(24 h)降幅/%Decrease低溫處理(48 h)Low temperature treatment(48 h)降幅/%Decrease低溫處理(72 h)Low temperature treatment(72 h)降幅/%Decrease雄蕊原基分化期矮抗5838.80±0.12a36.27±0.44b6.5233.34±0.26c14.0730.12±0.14d22.37Stamens and pistils differentiation stage鄭麥36635.00±0.13a22.00±0.34b37.1419.45±0.11c44.4312.35±0.26d64.71藥隔分化期矮抗5838.00±0.07a36.58±0.18b3.7434.56±0.26c9.0532.79±0.14d13.71Anther separation stage鄭麥36634.50±0.08a25.00±0.15b27.5421.46±0.18c37.8017.75±0.22d48.55四分體形成期矮抗5837.00±0.09a36.00±0.42b2.7035.26±0.34c4.7035.25±0.16c4.73Tetrad stage鄭麥36633.50±0.08a29.35±0.25b12.3923.56±0.29c29.6722.68±0.25d32.30

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters after data indicate that the difference is significant(P<0.05).

從小麥幼穗發(fā)育的3個時期來看，可溶性蛋白質(zhì)含量隨著幼穗發(fā)育的推進而不斷升高，小麥抗低溫能力也越來越強。

A.雌雄蕊原基分化期；B.藥隔分化期；C.四分體形成期。圖中不同小寫字母表示同一品種不同處理之間差異顯著(P<0.05)。圖4-8同。

A.Stamens and pistils differentiation stage; B.Anther separation stage; C.Tetrad stage. The different lowercase letters in the figure indicate that the difference between the different treatments of the same variety at the 0.05 level is significant.The same as Fig.4-8.

圖3 低溫處理對小麥幼穗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響
Fig.3 Effect of low temperature treatment on solubleprotein content in young ears of wheat

2.3 低溫脅迫對參試材料幼穗可溶性糖含量的影響

由圖4可知，雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期、四分體形成期經(jīng)低溫脅迫后，2個小麥品種可溶性糖含量在0～48 h內(nèi)均呈顯著上升趨勢； 48～72 h可溶性糖含量下降顯著。隨幼穗的發(fā)育，2個小麥品種的可溶性糖含量絕對值逐漸升高。

低溫處理下，矮抗58的可溶性糖含量均高于鄭麥366。2個小麥品種幼穗可溶性糖含量在低溫處理的48～72 h均出現(xiàn)了下降趨勢，但都高于對照?？扇苄蕴呛肯陆档目赡茉蚴请S著低溫處理時間的延長，植株需要更多的可溶性糖用于抵抗低溫的脅迫，可溶性糖的消耗速度大于幼穗產(chǎn)生可溶性糖的速度。

圖4 低溫處理對小麥幼穗可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of low temperature treatment on soluble sugar content in young ears of wheat

2.4 低溫脅迫對參試材料幼穗POD活性的影響

低溫脅迫后2個小麥品種幼穗POD活性均升高，且顯著高于對照。不同處理下矮抗58的POD活性均大于鄭麥366(圖5)。雌雄蕊原基分化期，低溫處理0～48 h，矮抗58的POD活性呈一直上升趨勢， 48～72 h略有下降；鄭麥366在低溫處理0～24 h內(nèi)，POD活性升高，24 h后開始下降(圖5-A)。藥隔分化期，矮抗58和鄭麥366幼穗POD活性變化趨勢一致，均在0～24 h升高，24 h后開始下降，但矮抗58幼穗POD活性高于鄭麥366，且下降速度小于鄭麥366(圖5-B)。四分體形成期，矮抗58的POD活性一直處于上升趨勢，而鄭麥366則在低溫處理的0～48 h內(nèi)，POD活性呈上升趨勢，48 h后略有下降(圖5-C)。

圖5 低溫處理對小麥幼穗POD活性的影響Fig.5 Effect of low temperature treatment on POD activity in young ears of wheat

2.5 低溫脅迫對參試材料幼穗SOD活性的影響

由圖6可知，低溫處理后，矮抗58和鄭麥366幼穗SOD活性均升高顯著；隨小麥幼穗發(fā)育的推進，矮抗58和鄭麥366幼穗SOD活性不斷升高,均顯著高于對照。

雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期和四分體形成期，2個小麥品種SOD活性均呈先升高后降低的趨勢。雌雄蕊原基分化期，矮抗58在低溫處理的24 h，SOD活性迅速達到最大值，24～72 h SOD活性緩慢下降；鄭麥366在低溫處理的0～48 h，SOD活性一直呈上升趨勢，48～72 h SOD活性開始下降(圖6-A)。藥隔分化期，矮抗58和鄭麥366在低溫處理的0～24 h，SOD活性迅速上升，之后開始下降。低溫處理24 h后，鄭麥366幼穗中SOD活性下降幅度明顯大于矮抗58(圖6-B)。四分體形成期，低溫處理下矮抗58的SOD活性變化較平緩，在低溫處理的0～48 h SOD活性一直呈上升趨勢，48～72 h 稍有下降。鄭麥366幼穗中SOD活性在低溫處理的0～12 h緩慢上升， 12～24 h迅速上升，24 h達到最大值，處理的24～72 h呈下降趨勢(圖6-C)。

圖6 低溫處理對小麥幼穗SOD活性的影響Fig.6 Effect of low temperature treatment on SOD activity in young ears of wheat

2.6 低溫脅迫對參試材料幼穗CAT活性的影響

由圖7可知，低溫處理后2個小麥品種幼穗CAT活性均顯著高于對照，并且呈先升高后降低的趨勢；隨幼穗的發(fā)育推進，CAT活性不斷升高。

雌雄蕊原基分化期，低溫處理0～12 h內(nèi)，參試材料的CAT活性緩慢升高，12～24 h則迅速升高。矮抗58在低溫處理24 h后CAT活性開始緩慢下降，鄭麥366則在低溫處理48 h后，CAT活性迅速下降(圖7-A)。藥隔分化期，低溫處理0～24 h，2個小麥品種的CAT活性均呈持續(xù)升高趨勢，24～48 h開始緩慢下降， 48 h后2個小麥品種均下降，但鄭麥366下降幅度明顯大于矮抗58(圖7-B)。四分體形成期低溫處理后，2個小麥品種CAT活性變化趨勢相同，在0～24 h緩慢上升， 24～72 h緩慢下降(圖7-C)。

圖7 低溫處理對小麥幼穗CAT活性的影響Fig.7 Effect of low temperature treatment on CAT activity in young ears of wheat

2.7 低溫脅迫對參試材料幼穗MDA含量的影響

低溫脅迫后，2個小麥品種MDA含量均顯著高于對照，隨處理時間的延長，MDA含量總體呈升高-降低-升高的趨勢(圖8)。

雌雄蕊原基分化期，低溫處理后，矮抗58幼穗中MDA含量小于鄭麥366。0～12 h，鄭麥366 MDA含量上升幅度大于矮抗58，12～24 h鄭麥366 MDA含量開始下降，24 h后又迅速升高。矮抗58在0～12 h內(nèi)，幼穗中MDA含量有所上升，但上升幅度不大，12～24 h緩慢下降，24 h后開始緩慢上升(圖8-A)。藥隔分化期低溫處理0～72 h內(nèi)，矮抗58和鄭麥366 MDA含量均呈現(xiàn)升高-降低-緩慢升高的趨勢，鄭麥366的MDA含量始終大于矮抗58(圖8-B)。四分體形成期低溫處理0～12 h內(nèi)，矮抗58和鄭麥366 MDA含量呈上升趨勢，低溫處理12 h后，MDA含量變化趨于平穩(wěn)(圖8-C)。

圖8 低溫處理對小麥幼穗MDA含量的影響Fig.8 Effect of low temperature treatment on MDA content in young ears of wheat

2.8 小麥穗粒數(shù)與生理生化指標的相關(guān)性分析

對不同穗分化時期低溫脅迫下2個小麥品種結(jié)實粒數(shù)與生理生化指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。低溫脅迫后，穗粒數(shù)與POD活性呈極顯著正相關(guān)，與MDA含量呈極顯著負相關(guān)，與SOD活性的相關(guān)性也達到顯著水平。

表2 低溫處理穗粒數(shù)與各生理指標的相關(guān)性Tab.2 Correlation of grain number per ear and physiological indices under low temperature

注：*表示0.05顯著水平；**表示0.01極顯著水平。

Note:*means significant difference at 0.05 level；**means significant difference at 0.01 level.

3 結(jié)論與討論

不同小麥品種遭受春季低溫危害的差異究竟是其幼穗發(fā)育進程差異還是品種自身抗倒春寒能力差異造成的，不同研究者存在不同觀點。多數(shù)研究者認為，對小麥抗倒春寒的研究需在同一發(fā)育進程且在低溫敏感期進行鑒定[7-8]。本研究以矮抗58和鄭麥366為材料，在保持其他因素一致的情況下，選擇幼穗分化相同時期(雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期、四分體形成期)進行抗倒春寒能力的研究，減少了不同發(fā)育時期造成的誤差，確保了試驗的準確性。研究者對于春季低溫脅迫下小麥凍害的敏感時期研究結(jié)果不盡相同。劉平湘等[9]、胡新等[10]認為，雌雄蕊分化末期到藥隔分化初期可能是小麥凍害的敏感時期；Single[11]認為，開花期為低溫敏感期；皇甫自起等[12]認為，小花分化期至藥隔形成期前后40多天均為敏感期；曾正兵等[13]認為，藥隔期之后為冬小麥幼穗分化低溫敏感期。本研究結(jié)果表明，矮抗58和鄭麥366在雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期、四分體形成期低溫脅迫后，穗粒數(shù)均有下降，且隨著低溫處理時間的延長，穗粒數(shù)降幅增大。2個小麥品種在同一處理強度下，隨著幼穗發(fā)育時期推后，小麥穗粒數(shù)降幅逐漸降低。對于不抗倒春寒小麥品種鄭麥366來說，雌雄蕊原基分化期對低溫最敏感，其次是藥隔分化期，四分體形成期也有影響，但影響較小。對于抗倒春寒小麥品種矮抗58來說，雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期短時間的低溫處理對穗粒數(shù)的影響不大，但隨著低溫處理時間的延長，穗粒數(shù)降幅有所增加；在四分體形成期，低溫處理的0～72 h內(nèi)對矮抗58的穗粒數(shù)影響均不大，說明矮抗58的低溫敏感期在雌雄蕊原基分化期，與劉平湘等[9]、胡新等[10]對敏感期的研究結(jié)果基本一致，與Single[11]、皇甫自起等[12]、曾正兵等[13]對敏感期的研究結(jié)果不同。

可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)與植物的抗寒性密切相關(guān)[14-18]，是細胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能增強細胞的持水力從而增強植物的抗寒性。本研究結(jié)果表明，在雌雄蕊原基分化期和藥隔分化期，2個小麥品種幼穗可溶性蛋白質(zhì)含量在低溫處理的0～24 h內(nèi)均呈持續(xù)增加趨勢，可溶性糖含量在低溫處理的0～48 h內(nèi)均呈連續(xù)增加趨勢。3個幼穗分化時期低溫處理下，矮抗58幼穗的可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量均大于鄭麥366；總體上隨低溫處理時間的延長，可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量均出現(xiàn)下降，矮抗58的下降幅度小于鄭麥366。下降的原因可能是持續(xù)低溫使處于低溫敏感期的幼穗消耗了更多的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)，而新合成可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的速率小于消耗的速率。在四分體形成期可溶性蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢，說明小麥幼穗在該發(fā)育時期能產(chǎn)生更多的可溶性蛋白質(zhì)以抵御低溫脅迫，這與李春燕等[19]對低溫脅迫下小麥不同發(fā)育時期葉片生理指標的研究結(jié)果相似。

綜上所述，在雌雄蕊原基分化期、藥隔分化期、四分體形成期，隨著低溫處理時間的延長，2個小麥品種的幼穗受到不同程度的損傷。隨著幼穗發(fā)育的推進，小麥幼穗的抗低溫能力逐漸增強。不同時期低溫處理下，從雌雄蕊原基分化期到四分體形成期小麥穗粒數(shù)逐漸增多。說明雌雄蕊原基分化期是幼穗低溫最敏感時期。生理特性研究結(jié)果表明，抗春季低溫脅迫小麥品種較低溫敏感品種的幼穗膜脂過氧化程度輕，積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)較多，抗氧化酶活性較強，小麥幼穗通過多種方式協(xié)調(diào)來適應春季低溫脅迫，小麥抗春季低溫在生理指標上表現(xiàn)出多方面的綜合防御。綜合穗粒數(shù)、生理指標變化及相關(guān)性分析，可以把POD、SOD活性和MDA含量作為小麥幼穗抗倒春寒特性的生理評價指標。