李晨輝 趙子捷 陳文燁 焦義然 楊帆 劉永偉 董福雙 杜進(jìn)民 周碩

摘要：為深入了解不同類植物CaM1基因（calmodulin 1，簡稱CaM1）在抵抗逆境進(jìn)化過程所形成的密碼子的使用特征和遺傳差異。運(yùn)用CodonW、BioEdit和MEGA軟件對43種植物序列進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，CaM1基因?qū)γ艽a子的使用具有極強(qiáng)的偏好性，CUC、AUC、UCU、CCA、ACU、UGA為其最優(yōu)密碼子，禾本目植物更偏好使用G/C堿基。G、C堿基含量和位置是引起CaM1基因密碼子偏性的主要原因。遺傳距離分析表明，山柑目與白花菜目之間的親緣關(guān)系最近，豆目和無患子目間的親緣關(guān)系次之，與聚類分析結(jié)果相符。

關(guān)鍵詞：CaM1;密碼子偏性;遺傳距離;親緣關(guān)系

中圖分類號： S188? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0028-04

收稿日期：2017-11-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號：31600216）;河北省自然科學(xué)基金青年基金（編號：C2017301066）;河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新工程項(xiàng)目（編號：2019-4-8）。

作者簡介：李晨輝（1984—），男，河北保定人，博士，工程師，主要從事生物工程研究。E-mail：li.chen.hui@163.com。

通信作者：杜進(jìn)民，博士，教授，主要從事生物技術(shù)研究，E-mail：13933106571@163.com;周 碩，博士，副研究員，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究，E-mail：zhoushuobio@163.com。

植物體內(nèi)存在眾多的信號通路，其中鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞生命活動(dòng)是其重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一[1]。鈣調(diào)素（calmodulin，簡稱CaM） 不僅參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]，其活化后還能結(jié)合多種酶來調(diào)節(jié)酶活性，形成相應(yīng)的生理生化反應(yīng)，從而對植物細(xì)胞分裂、伸長、生長、發(fā)育和抗逆等活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[3]，并對花粉萌發(fā)和花粉管伸長具有促進(jìn)作用[4]。在一種植物體內(nèi)，可存在多種CAM亞型基因，且不同亞型基因間的序列具有高度的同源性，但存在的這些差異也使其不同的亞型具有相應(yīng)的生理功能[5-6]。脫氧核糖核酸或核糖核酸與其編碼蛋白之間的關(guān)系可以通過密碼子來表示[7]。一共有64種遺傳密碼來編碼20種氨基酸[8]，這種編碼同一個(gè)氨基酸的密碼子稱為同義密碼子，在翻譯成氨基酸的整個(gè)環(huán)節(jié)中，基因?qū)νx密碼子的使用具有不平衡性，還存在物種的差異性等特征[9]?；蛎艽a子偏好性的研究有利于基因水平轉(zhuǎn)移及其家族分化的研究[10]。因此，CaM1基因密碼子偏好性的分析能更好地揭示其在系統(tǒng)分類研究中的有效性。

在同一種植物體的不同組織和不同發(fā)育階段，CaM基因的表達(dá)存在差異[11]。程玉豆等克隆出鴨梨CaM基因2種亞型（命名為PbCaM1和PbCaM2），發(fā)現(xiàn)這2種亞型在成葉、盛花期花瓣及幼果期的表達(dá)量較高[12]。郭麗君發(fā)現(xiàn)美國山核桃CaM基因在不同組織和發(fā)育階段也不一致，在葉中的表達(dá)量最高，其次分別是嫩葉和內(nèi)莖[13]。趙芊等在研究擬南芥7個(gè)CaM亞型基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同亞型的表達(dá)量均受到細(xì)菌信號3-羰基辛?；呓z氨酸內(nèi)酯不同程度的誘導(dǎo)，且野生型CaM1基因處理6 h達(dá)到表達(dá)高峰[5]。薛敏等在非生物脅迫條件下，克隆出沙冬青CaM1基因，通過RT-PCR方法證實(shí)其在低溫、干旱和鹽脅迫下表達(dá)水平上調(diào)[14]。趙晶等發(fā)現(xiàn)灰皮支黑豆和感病品種遼豆15根部在線蟲侵染后的第5天，抗感品種的CaM1基因的表達(dá)量最高[15]。

對植物CaM1基因在不同條件下的表達(dá)量進(jìn)行深入研究，對揭示鈣離子參與的信號通路有重要意義，但目前為止還未見CaM1基因密碼子使用模式的報(bào)道，這對后期開展異源表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)試驗(yàn)都是不利的。本研究以43種植物CaM1基因密碼子使用特征為切入點(diǎn)進(jìn)行其進(jìn)化和分類的研究，通過CodonW分析了43種（12類）植物CaM1基因密碼子偏好性，運(yùn)用Bioedit和MEGA軟件對遺傳距離和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以期為CaM1基因在植物中的進(jìn)化和分類提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)的時(shí)間和地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2017年進(jìn)行，目的基因的搜集在河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院完成，生物信息學(xué)分析在河北菲尼斯生物技術(shù)有限公司和河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所完成。

1.2 目的基因的導(dǎo)入

本研究所用基因資料都來源于Nucleotide（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）數(shù)據(jù)庫，43種植物CaM1基因含有禾本目、薔薇目、管狀花目、白花菜目、山柑目、傘形目、茄目、豆目、菊目、鼠李目、無患子目和蕓香目。43種植物CaM1基因序列都是完整的編碼區(qū)序列，序列全長為450 bp。如表1所示，利用MEGA 6.0對上述序列進(jìn)行堿基分析。

1.3 不同密碼子使用偏性指標(biāo)分析

利用CodonW軟件計(jì)算ENc、GC、GC3s、CBI和相對同義密碼子使用度（relative synonymous coon usage，RSCU）的值，分析CaM1基因密碼子使用偏性; 并計(jì)算GC、GC3s、蛋白質(zhì)親水

1.4 遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用BioEdit軟件對43種植物CaM1基因cDNA序列進(jìn)行比對，將比對結(jié)果保存為fasta格式，通過MEGA軟件中Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離。利用MEGA軟件的鄰近法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉檢驗(yàn)法（Bootstrap method=1 000）校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物CaM1基因序列堿基特征

如表1所示，編碼CaM1基因的43種植物的核苷酸全長均是450 bp。在ATCG堿基分布中，禾本目的小麥、玉米、水稻、二穗短柄草、大麥和甘蔗，薔薇目的節(jié)節(jié)麥、小米、花生、蕓豆和綠豆，管狀花目的芝麻，白花菜目的蕪菁和醉蝶花，上述物種的A+T堿基含量均低于G+C堿基含量，其余物種G+C堿基含量高于A+T堿基含量，表明CaM1基因更傾向于使用G或C堿基。

2.2 密碼子使用偏性指標(biāo)及其影響因素分析

如表1所示，玉米的ENc值最小，為29.15，且禾本目其余植物的ENc值也明顯小于其他植物，表明禾本目的植物對密碼子使用具有較強(qiáng)的偏好性，43種植物中，只有12種植物的ENc值高于55，ENc值最高的植物為鷹嘴豆和葡萄（ENc=61.00），表明大多數(shù)植物CaM1基因?qū)νx密碼子的使用具有較強(qiáng)的偏好性。禾本目植物的GC含量值和密碼子第3位的GC含量值是所有植物中最高的，表明禾本目植物偏愛使用G、C堿基。在43種植物中，禾本目的玉米、水稻，薔薇目的小米，白花菜目的醉蝶花，山柑目的擬南芥、亞麻薺的CBI值均大于0.2，禾本目的二穗短柄草、大麥，薔薇目的節(jié)節(jié)麥、花生，白花菜目的蘿卜、蕪菁的CBI值均大于0.1，其余植物的CBI值接近0，表明禾本目、薔薇目、白花菜目和山柑目的CaM1基因密碼子使用偏好性大于其他植物。同義密碼子相對使用度的結(jié)果表明，43種植物對CUC、AUC、UCU、CCA、ACU、UGA（終止密碼子）、CAU和UGC具有極強(qiáng)的偏好性（RSCU>1.5），除上述密碼子外，禾本目植物更偏向使用GUC、UCC、UCG、AGC、ACC、UAC、CAG、GAG、CGC、GGC（RSCU>1.5），這與其他11種分類植物密碼子的使用特征不一致。如表2所示，GC含量和密碼子第3位的GC含量均與密碼子偏愛指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，但與有效密碼子數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明G、C堿基的含量和位置對CaM1基因密碼子偏性具有重要影響。

2.3 不同植物CMA1基因的遺傳距離分析

不同植物種群間Kimura雙參數(shù)距離如表3所示，各分類群體間遺傳距離變異區(qū)間在0.11～0.22之間波動(dòng)，其中山柑目和白花菜目之間的遺傳距離最近，雙參數(shù)距離值為011，其次是豆目和無患子目。白花菜目與菊目、山柑目與蕓香目之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，雙參數(shù)距離值均為0.22，其次是豆目與菊目、白花菜目與管狀花目、白花菜目與蕓香目。

2.4 不同植物CMA1基因的聚類分析

如圖1所示，43種植物明顯分為5類：禾本目（小麥、玉米、二穗短柄草、大麥、甘蔗）和薔薇目（節(jié)節(jié)麥、小米、花生、蕓豆、綠豆）間的親緣關(guān)系較近;薔薇目（蒺藜狀苜蓿、豌豆、木豆）與豆目（大豆、狹葉羽扇豆、鷹嘴豆）和無患子目（冬青）間的親緣關(guān)系較近;薔薇目（蘋果、白梨），傘形目（人參、西香芹菜），鼠李目（葡萄、棗）和蕓香目（克萊門柚）間的親緣關(guān)系較近;管狀花目（番茄、馬鈴薯、矮牽牛）和茄目（簇生椒、煙草）間的親緣關(guān)系較近;白花菜目（小鹽芥、蘿卜、蕪菁、醉蝶花）和山柑目（擬南芥、亞麻薺）間的親緣關(guān)系較近，且同一目下的各個(gè)植物間的親緣關(guān)系更近。

3 討論與結(jié)論

密碼子偏好性的研究為了解物種起源于進(jìn)化、目的基因的改造、推測未知基因表達(dá)水平及預(yù)測目的基因最佳宿主奠定了理論基礎(chǔ)[16-17]，同時(shí)為轉(zhuǎn)基因研究中的甲基化能否引起基因表達(dá)量下降或基因沉默提供參考[18]。

本研究通過分析43種不同植物的密碼子使用特征，發(fā)現(xiàn)其有效密碼子數(shù)（29.15≤ENc≤61.00）和密碼子偏愛指數(shù)這2種指標(biāo)表明不同植物CaM1基因?qū)γ艽a子的使用具有極強(qiáng)的偏好性，通過GC含量、密碼子第3位的GC含量和同義密碼子相對使用度這3種指標(biāo)證實(shí)不同植物CaM1基因?qū)、C堿基的使用有極強(qiáng)的偏好性，尤其是對終止密碼子UGA，以及CUC、AUC、UCU、CCA、ACU密碼子的使用。禾本目與其他分類植物相比，更傾向于使用G/C結(jié)尾的堿基，引起其GC3s值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他植物，且GUC、UCC、UCG、AGC、ACC、UAC、CAG、GAG、CGC、GGC為其最主要的偏愛密碼子。分析影響CaM1基因密碼子使用偏性的原因發(fā)現(xiàn)，G、C堿基的含量和位置對CaM1基因密碼子偏性具有重要影響。關(guān)于影響密碼子偏好性的原因，有研究報(bào)道，反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA序列長度、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA豐度、突變和自然選擇等都可造成基因?qū)δ承┟艽a子的使用具有極強(qiáng)的偏好性[19]。GC堿基含量會造成同義密碼子在使用上具有偏好性的特點(diǎn)，且其偏好性越強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)該基因以G/C堿基結(jié)尾的可能性越大，而且GC3s對該基因密碼子偏好性有主導(dǎo)作用[20]。每種生物都有可能面臨非自然選擇壓力，這種非自然選擇壓力會促使物種的密碼子第3位堿基種類發(fā)生變化[21]。蘇麗艷等發(fā)現(xiàn)蘋果CaM基因有響應(yīng)損傷、高溫、低氧等非生物脅迫的能力， 在適應(yīng)脅迫環(huán)境初期過程中不可或缺[22]。在體溫脅迫下，茶樹CaM蛋白也可介導(dǎo)鈣信號從而提高適應(yīng)低溫環(huán)境的能力[23]。趙存鵬等發(fā)現(xiàn)棉花在脅迫處理后，轉(zhuǎn)入CaM基因能提高棉花抵御低溫的能力[24]。

基因DNA水平上的分析更有利于基因功能信息的獲取，本研究分析12種不同分類植物CaM1基因的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，山柑目與白花菜目之間的遺傳距離值最小，其次是豆目和無患子目，這與基于鄰近法構(gòu)建的聚類圖一致，表明遺傳距離和聚類分析都能描述物種間的親緣關(guān)系。CaM1基因密碼子使用特征的確定為研究影響植物抗逆因素及開展抗逆品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)，并為深入建立轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)提供最優(yōu)密碼子的理論依據(jù)。

本研究分析了43種植物CaM1基因密碼子使用特征，發(fā)現(xiàn)不同類植物CaM1基因?qū)γ艽a子的使用具有較強(qiáng)的偏好性，尤其偏好使用G/C堿基，CUC、AUC、UCU、CCA、ACU和UGA為最優(yōu)密碼子，禾本目植物更偏向使用G/C結(jié)尾的堿基。G、C堿基的含量和位置是影響CaM1基因密碼子偏性的主要原因。遺傳距離分析得出的親緣關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kudla J，Batistic O，Hashimoto K. Calcium signals：the lead currency of plant information processing[J]. The Plant Cell，2010，22（3）：541-563.

[2]Sanders D，Brownlee C，Harper J F. Communicating with calcium[J]. The Plant Cell，1999，11（4）：691-706.

[3]張俊紅. CaM對增強(qiáng)UV-B輻射小麥幼苗抗氧化系統(tǒng)調(diào)控的研究[D]. 臨汾：山西師范大學(xué)，2010.

[4]Yang X E，Wang S S，Wang M，et al. Arabidopsis thaliana calmodulin-like protein CML24 regulates pollen tube growth by modulating the actin cytoskeleton and controlling the cytosolic Ca2+ concentration[J]. Plant Molecular Biology，2014，86（3）：225-236.

[5]趙 芊，張 超，劉 方，等. 鈣調(diào)素參與細(xì)菌信號3-羰基辛?；呓z氨酸內(nèi)酯對擬南芥主根生長的調(diào)控[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2016，52（6）：933-940.

[6]劉 偉. 小麥與葉銹菌互作過程中CaM的亞細(xì)胞定位和CaM亞型的抗體制備[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[7]劉慶坡，薛慶中. 遺傳密碼子及其應(yīng)用[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2006，22（11）：851-855.

[8]周 丹，薛仁余，張曉峰，等. 鯉和斑馬魚HOX基因家族同義密碼子使用偏性的分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志，2013，26（2）：19-25.

[9]朱孝軒，朱英杰，宋經(jīng)元，等. 基于全基因組和轉(zhuǎn)錄組分析的赤芝密碼子使用偏好性比較研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（9）：1340-1345.

[10]Wei L，He J，Jia X，et al. Analysis of codon usage bias of mitochondrial genome in Bombyx mori and its relation to evolution[J]. BMC Evolutionary Biology，2014，14：262.

[11]劉新穎，王曉杰，薛 杰，等. 小麥鈣調(diào)素新亞型TaCaM5的克隆及表達(dá)分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，2010，36（6）：953-960.

[12]程玉豆，葛文雅，閆洪波，等. ‘鴨梨鈣調(diào)素基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，39（2）：58-63.

[13]郭麗君. 美國山核桃CaM基因的克隆及在鹽脅迫下的表達(dá)[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2013.

[14]薛 敏，王雪峰，王志林，等. 沙冬青AmCaM1基因的克隆及其功能初步分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2015，16（6）：1315-1320.

[15]趙 晶，王媛媛，朱曉峰，等. 線蟲脅迫下大豆鈣調(diào)蛋白基因的表達(dá)分析[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2017，39（1）：91-98.

[16]吳憲明，吳松鋒，任大明，等. 密碼子偏性的分析方法及相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2007，29（4）：420-426.

[17]宗秋芳，戴開宇，劉 穎，等. 豬氨肽酶N（APN）基因密碼子偏好性分析[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2016，37（2）：45-50，73.

[18]張 樂，金龍國，羅 玲，等. 大豆基因組和轉(zhuǎn)錄組的核基因密碼子使用偏好性分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（6）：965-974.

[19]Liu G，Wu J，Yang H，et al. Codon usage patterns in Corynebacterium glutamicum：mutational bias，natural selection and amino acid conservation[J]. Comparative and Functional Genomics，2010：343569.

[20]Carlini D B，Chen Y，Stephan W. The relationship between third-codon position nucleotide content，codon bias，mRNA secondary? structure and gene expression in the drosophilid alcohol dehydrogenase genes Adh and Adhr[J]. Genetics，2001，159（2）：623-633.

[21]時(shí) 慧，王 玉，楊路成，等. 茶樹抗寒調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ICE1密碼子偏性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2012，39（7）：1341-1352.

[22]蘇麗艷，田愛梅，陶貴榮，等. 蘋果MdCaM的克隆及其對果實(shí)釆后非生物脅迫的響應(yīng)[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2017，32（1）：47-52.

[23]Wang X C，Zhao Q Y，Ma C L，et al. Global transcriptome profiles of Camellia sinensis during cold acclimation[J]. BMC Genomics，2013，14：415.

[24]趙存鵬，郭寶生，王凱輝，等. 通過轉(zhuǎn)CaM基因提高了棉花抗寒性[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2016，28（3）：234-241.陸秀娟，潘 虹，李祥棟，等. 薏苡種質(zhì)資源ISSR分子標(biāo)記篩選及親緣關(guān)系分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（5）：32-36.