周宇 李海松 謝知音 王彬 管思琪 王繼升

摘要：目的? 觀察益腎通淋方對良性前列腺增生（BPH）大鼠前列腺PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響，探討其作用機(jī)制。方法? 采用去勢聯(lián)合丙酸睪酮注射方法建立BPH模型，對照組行假手術(shù)。將60只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性藥組和益腎通淋方高、低劑量組，每組12只。于去勢第8日開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)28 d。末次給藥后1 h，大鼠麻醉取前列腺，計(jì)算前列腺指數(shù)，HE染色觀察前列腺組織病理形態(tài)，Western blot和RT-PCR分別檢測前列腺PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果? 與對照組比較，模型組大鼠前列腺明顯增生，PI3K、Akt和mTOR磷酸化蛋白及mRNA表達(dá)均顯著升高，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活;益腎通淋方干預(yù)后，模型大鼠前列腺指數(shù)下降，腺體變少，腺腔擴(kuò)張，前列腺增生明顯緩解，同時(shí)PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平降低，mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)論? 益腎通淋方能有效改善BPH大鼠前列腺增生，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：益腎通淋方;良性前列腺增生;PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路;大鼠

中圖分類號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）07-0056-04

Abstract： Objective To investigate the effects of Yishen Tonglin Prescription on prostate PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in benign prostatic hyperplasia （BPH） rats; To discuss its mechanism of action. Methods The BPH model was established by the method of castration combined with testosterone propionate injection. The control group received sham-operation. Totally sixty SD rats were randomly divided into control group， model group， positive medicine group， and Yishen Tonglin Prescription high- and low-dosage groups， with 12 rats in each group. Gavage was started on the 8th day after castration， once a day for 28 days. One hour after the last administration， the rats were anesthetized， and the prostate tissue was taken to calculate the prostate index. The pathological changes of prostate tissue were observed by HE staining. The expression levels of protein and mRNA in prostate PI3K/Akt/mTOR pathway were detected by Western blot and RT-PCR respectively. Results Compared with the control group， the prostatic hyperplasia was evident in the model group， the phosphorylation level and mRNA expression of PI3K， Akt and mTOR significantly increased， and the PI3K/Akt/mTOR pathway was activated. After the intervention of Yishen Tonglin Prescription， the prostate index of the model rats decreased， the glands become fewer， the glandular cavity dilated， the prostate hyperplasia was relieved， the phosphorylation levels of PI3K， Akt and mTOR decreased， and the mRNA expression was significantly down-regulated. Conclusion Yishen Tonglin Prescription can effectively improve prostatic hyperplasia in BPH rats， and its mechanism may be related to inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Keywords： Yishen Tonglin Prescription; benign prostatic hyperplasia; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; rats

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是男科常見病，主要是由于性激素代謝障礙導(dǎo)致不同程度腺體或纖維、肌肉組織增生而造成的前列腺體積增大，臨床多表現(xiàn)為尿頻尿急、排尿困難、夜尿增多等[1]。BPH發(fā)病率隨著男性年齡的增長而升高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，50歲以上男性BPH發(fā)病率為50%～60%[2]。目前，BPH發(fā)病機(jī)制尚未明了，其臨床治療包括外科手術(shù)和5α-還原酶抑制劑、α受體拮抗劑等藥物治療，但均存在較明顯的局限性和不良反應(yīng)[3]。有研究顯示，中藥復(fù)方對BPH大鼠細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，能明顯改善相應(yīng)癥狀[4-5]。益腎通淋方為李海松教授臨床治療BPH的經(jīng)驗(yàn)方，以補(bǔ)腎益氣、清熱利濕為治則。本研究在建立BPH大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察其對BPH大鼠的治療效果，并以與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討其療效機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為180～220 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于溫度（24±2）℃、相對濕度（50±5）%環(huán)境，明暗周期12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

益腎通淋方（熟地黃15 g、牛膝9 g、黃芪15 g、菟絲子9 g、丹參6 g、土茯苓9 g、金錢草15 g、玉米須15 g、冬瓜子6 g、甘草6 g等），飲片均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房，全方煎煮2次，第1次加10倍量水，第2次加8倍量水，2次煎液合并，濃縮，保存?zhèn)溆?非那雄胺片，杭州默沙東制藥有限公司，5 mg/片，批號(hào)306713。

1.3? 主要試劑與儀器

兔抗鼠p-PI3K、p-Akt、p-mTOR多克隆抗體（英國Abcam），兔抗鼠GAPDH單克隆抗體（美國CST），山羊抗兔二抗（武漢博士德），PVDF膜（美國Thermo），BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京中衫金橋），SYBR MasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara）。組織切片機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Thermo），光學(xué)顯微鏡（德國ZEISS），超微量核酸蛋白測定儀（英國BioDrop），凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad）。

1.4? 分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性藥組和益腎通淋方高、低劑量組，每組12只。除對照組大鼠外，其余組均采用去勢術(shù)聯(lián)合丙酸睪酮注射建立BPH模型[6]。操作方法：大鼠麻醉，去毛，常規(guī)消毒，打開腹腔，經(jīng)陰囊摘除雙側(cè)睪丸，于殘端處結(jié)扎止血后縫合皮膚。去勢術(shù)后大鼠自行恢復(fù)7 d，于第8日皮下注射丙酸睪酮（5 mg/kg），每日1次，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對照組大鼠予假手術(shù)對照，打開腹腔后游離但不摘除雙側(cè)睪丸，結(jié)扎止血后縫合。

1.5? 給藥及取材

于去勢后第8日開始灌胃給藥，其中陽性藥組予臨床等效1倍劑量非那雄胺片（0.45 mg/kg），益腎通淋方高、低劑量組分別予臨床等效2、1倍劑量益腎通淋方（21.6、10.8 g/kg），對照組和模型組予等體積蒸餾水。給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)28 d。末次給藥后1 h，大鼠麻醉，取前列腺，稱重，一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分置于液氮中凍存。

1.6? 指標(biāo)檢測

1.6.1? 前列腺指數(shù)測定

大鼠前列腺稱重后記錄數(shù)值，計(jì)算前列腺指數(shù)[前列腺質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g）]。

1.6.2? 病理形態(tài)觀察

HE染色觀察大鼠前列腺組織病理形態(tài)，取固定于多聚甲醛溶液中前列腺組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，5 μm厚連續(xù)切片，經(jīng)蘇木素-伊紅染色后脫水并用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病變情況，并拍照分析。

1.6.3? Western blot檢測前列腺PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)

取凍存的前列腺組織，稱重，加入5倍量RIPA強(qiáng)力裂解液，冰上勻漿后離心，分離上清液，BCA法測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣（30 μg），上樣完成后，將玻璃板置于電泳槽中，以恒壓80 V進(jìn)行凝膠電泳，至溴酚藍(lán)完全跑出分離膠后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后一抗（內(nèi)參為GAPDH，均按1∶1000稀釋），4 ℃孵育過夜。次日用TBST液沖洗條帶4次×10 min，加入二抗室溫孵育4 h（1∶1000稀釋），TBST液沖洗4次×10 min，化學(xué)發(fā)光法顯影。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.6.4? RT-PCR檢測前列腺PI3K/Akt/mTOR通路mRNA表達(dá)

取前列腺組織于研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，重復(fù)3次，待研磨完全后，加入1 mL Trizol試劑提取組織總RNA，檢測含量合格后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作要求將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增目的基因產(chǎn)物，條件：95 ℃、15 min預(yù)變性，95 ℃、10 s變性，60 ℃、30 s退火延伸，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算Ct值，以2-ΔΔCt法分析各基因的相對表達(dá)量。引物由深圳華大基因公司合成，β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列見表1。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較用方差分析，采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2? 結(jié)果

2.1? 益腎通淋方對模型大鼠前列腺指數(shù)的影響

與對照組比較，模型大鼠前列腺指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠前列腺指數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

2.2? 益腎通淋方對模型大鼠前列腺病理形態(tài)的影響

對照組大鼠前列腺腺體分布均一，腺腔大小正常，腺上皮細(xì)胞排列整齊，無皺褶;模型組大鼠前列腺腺體多且密集，腺腔顯著縮小，上皮細(xì)胞皺褶明顯增多，間質(zhì)變薄;各給藥組大鼠前列腺腺體增生明顯減少，腺腔有一定程度的擴(kuò)張，腺上皮細(xì)胞皺褶基本消失，間質(zhì)增厚，整體恢復(fù)良好，且高劑量組改善明顯優(yōu)于低劑量組。見圖1。

2.3? 益腎通淋方對模型大鼠前列腺PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠前列腺p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，除益腎通淋方低劑量組p-PI3K外，各給藥組大鼠前列腺p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖2、表3。

2.4? 益腎通淋方對模型大鼠前列腺PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠前列腺PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，益腎通淋方高劑量組和陽性藥組大鼠前列腺PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表4。

3? 討論

BPH屬中醫(yī)學(xué)“癃閉”范疇，病機(jī)可用“腎氣虧虛、濕熱蘊(yùn)結(jié)”概括，治當(dāng)補(bǔ)腎益氣、清熱利濕。益腎通淋方中熟地黃、牛膝、菟絲子平補(bǔ)腎中陰陽以益腎填精，黃芪、丹參補(bǔ)氣活血，土茯苓、金錢草利濕通淋，甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，攻補(bǔ)兼施，共奏補(bǔ)腎益氣、清熱利濕功效。

本研究采用去勢術(shù)聯(lián)合丙酸睪酮注射建立BPH模型，發(fā)現(xiàn)模型大鼠前列腺異常肥大，前列腺指數(shù)為正常大鼠2倍;病理切片顯示，大鼠前列腺腺體多且密集，腺腔顯著縮小，上皮細(xì)胞皺褶增多，細(xì)胞間質(zhì)變薄。經(jīng)益腎通淋方治療后，模型大鼠前列腺指數(shù)顯著下降，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)腺體變少，腺腔擴(kuò)張，腺上皮細(xì)胞皺褶基本消失，間質(zhì)增厚，前列腺增生得到緩解。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡等過程中起關(guān)鍵作用[7]。PI3K是PI3K/Akt/mTOR通路的上游啟動(dòng)分子，當(dāng)細(xì)胞受到外界應(yīng)激后，細(xì)胞膜上PI3K磷酸化成PIP3，PIP3可使Akt從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞膜，并使其Thr308位點(diǎn)磷酸化，活化的Akt一方面能自身發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的功能，另一方面能激活其下游的mTOR分子，mTOR活化后，細(xì)胞抗凋亡能力進(jìn)一步增加，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖[8-10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路具有抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)其增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及血管生成等作用，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，BPH大鼠前列腺PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平及mRNA表達(dá)較對照組均明顯升高，說明PI3K/Akt/mTOR通路過度激活，可能與腺體增加、腺腔縮小等病理現(xiàn)象有關(guān);在益腎通淋方干預(yù)后，PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平及mRNA表達(dá)均明顯改善，說明該中藥復(fù)方能調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路，而這一過程可能與改善BPH大鼠前列腺增生有關(guān)。

綜上，益腎通淋方能降低BPH大鼠前列腺指數(shù)，改善前列腺增生，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/ mTOR信號(hào)通路有關(guān)，本研究為其臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

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