王義洲，劉曄宏，徐首紅,＊，劉洪來

1華東理工大學(xué)，結(jié)構(gòu)可控先進(jìn)功能材料及其制備教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

2華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237

1 引言

環(huán)境響應(yīng)型聚合物，又被稱為智能型聚合物，是指能夠響應(yīng)外部環(huán)境的微小刺激而改變自身物理化學(xué)性質(zhì)的一類聚合物。根據(jù)不同的刺激信號(hào)，可以構(gòu)建不同類型的環(huán)境響應(yīng)型聚合物，比如溫度響應(yīng)1-3、pH響應(yīng)4-6、光響應(yīng)7,8、超聲響應(yīng)9,10、場響應(yīng)11-13型聚合物等。利用環(huán)境響應(yīng)型聚合物的特點(diǎn)和特殊環(huán)境下獨(dú)有的不同條件刺激，可以構(gòu)建多種在特定環(huán)境下具有特殊意義的材料。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織較正常組織而言有很多不同的性質(zhì)。腫瘤實(shí)質(zhì)上是不受機(jī)體控制的快速大量增殖的細(xì)胞，毛細(xì)血管和淋巴管系統(tǒng)的增殖和完善速度跟不上癌細(xì)胞的增殖速度，所以癌細(xì)胞區(qū)域血管的通透性較強(qiáng)而異物清除速率較低，在這種高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))14,15的作用下，很多種類型具有合適粒徑的藥物載體可以被動(dòng)靶向到腫瘤部位而降低對(duì)正常組織的毒副作用16。傳統(tǒng)的藥物載體有很多缺點(diǎn)，例如在到達(dá)腫瘤區(qū)域后只能依靠細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)入癌細(xì)胞、藥物釋放緩慢等，從而導(dǎo)致難以在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到有效的藥物濃度17。因此，環(huán)境響應(yīng)型聚合物的發(fā)展為藥物載體的開發(fā)帶來了新的機(jī)遇。

癌細(xì)胞的異常行為導(dǎo)致腫瘤區(qū)域與正常組織在微環(huán)境上有很多差異。腫瘤細(xì)胞極其旺盛的代謝致使腫瘤區(qū)域處于缺氧環(huán)境中，會(huì)產(chǎn)生過多的乳酸代謝物，再加上清除速率較低，所以腫瘤區(qū)域微環(huán)境呈弱酸性(pH 6.5)18。癌細(xì)胞的快速大量增殖需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)提供能量或作為原料，所以癌細(xì)胞表面會(huì)過量表達(dá)多種受體，助其從周圍的組織液或血液中捕獲所需的物質(zhì)，而且癌細(xì)胞內(nèi)和表面很多種酶的濃度和活性都會(huì)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞19。此外，由于腫瘤區(qū)域的毛細(xì)血管系統(tǒng)不夠完善，所以血流量較低，散熱較慢，再加上細(xì)胞活動(dòng)頻繁，所以腫瘤區(qū)域溫度較高，且在相同的受熱條件下，腫瘤組織的溫度會(huì)顯著高于正常組織20。因此，多種溫度響應(yīng)材料、pH響應(yīng)材料以及可以與癌細(xì)胞表面受體結(jié)合的配體等多種功能材料被用來構(gòu)建智能型藥物載體用于腫瘤的治療21-23，既提高了對(duì)腫瘤的殺傷作用，又降低了對(duì)正常組織的毒副作用。

聚甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯(PDPA)是一種pH響應(yīng)型的聚合物24，在酸性環(huán)境下呈親水性，中性和堿性環(huán)境下呈疏水性，其與聚乙二醇單甲醚(mPEG)形成的兩嵌段和三嵌段型兩親聚合物都可以用于制備智能型藥物載體并很好地控制藥物釋放25。聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)和2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)的混聚物在親水性和生物相容性方面與經(jīng)典的聚乙二醇相差無幾，而且這種混聚物還具有可以調(diào)節(jié)的低臨界溶解溫度(LCST)26-28，在溫度高于和低于其LCST的情況下，混聚物的親疏水性發(fā)生扭轉(zhuǎn)，聚合物鏈分別呈塌縮和舒展?fàn)顟B(tài)，可以對(duì)其它功能分子起到保護(hù)和去保護(hù)的作用，因而更具有應(yīng)用價(jià)值。

本文合成了溫度敏感的無規(guī)共聚物，并研究了兩種單體的配比與聚合物L(fēng)CST之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上又利用連續(xù)ATRP法合成了pH和溫度雙重敏感的聚合物，并對(duì)其LCST及pH響應(yīng)性和聚合物的組成之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。最后將具有合適LCST的聚合物制成膠束，進(jìn)行體外模擬釋藥實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑

2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA，95%)、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA，95%，相對(duì)分子質(zhì)量500)、甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯(DPA，98%)均來自Sigma-Aldrich公司，通過堿性氧化鋁層析柱除阻聚劑后待用。溴化亞銅(CuBr，AR)購買自上海麥克林生化科技有限公司，經(jīng)冰乙酸、乙醇洗滌三次后真空干燥，密封保存待用。無水二氯甲烷(CH2Cl2，AR，含分子篩)、1,1,4,7,7-五甲基二乙烯三胺(PMDETA，98%)和2-溴異丁酸乙酯(EBiB，98%)購買自上海麥克林生化科技有限公司。氘代氯仿(CDCl3，AR)和重水(D2O，AR)購買自百靈威科技有限公司。堿性氧化鋁(200-300目)、中性氧化鋁(200-300目)、鹽酸(AR)、氫氧化鈉(AR)、正己烷(AR)、四氫呋喃(THF，AR)和冰乙酸(AR)等購買自上海泰坦科技股份有限公司。

2.2 溫敏共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)的合成

本實(shí)驗(yàn)用無水二氯甲烷做溶劑，在30 °C下用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)法合成共聚物。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向干燥潔凈的史萊克管中依次加入單體MEO2MA和OEGMA，溶劑無水二氯甲烷，引發(fā)劑EBiB和配體PMDETA。將體系用液氮冷凍-抽真空-充氮?dú)獗Ｗo(hù)下解凍循環(huán)操作三次，再次將體系冷凍，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入催化劑CuBr，抽真空后解凍，轉(zhuǎn)移到30 °C的恒溫箱中繼續(xù)反應(yīng)。其中，各物質(zhì)的投料比(按物質(zhì)的量計(jì)算)為[MEO2MA] :[OEGMA] : [EBiB] : [PMDETA] : [CuBr] = m : n :1 : 2 : 1 (其中，m + n = 100)，溶劑的體積是單體體積的2倍。反應(yīng)12 h后，取適量反應(yīng)混合物溶于CDCl3中，用核磁共振波譜儀進(jìn)行檢測，計(jì)算反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。向反應(yīng)體系中滴加幾滴異丙醇終止反應(yīng)，用四氫呋喃稀釋后通過中性氧化鋁層析柱除去反應(yīng)體系中的催化體系。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大量的溶劑，得到無色粘稠液體，加入正己烷中沉降，用四氫呋喃和正己烷溶解-沉降3次純化產(chǎn)物，最后在真空干燥箱中干燥至恒重，得到無色透明的粘稠狀物質(zhì)，取適量產(chǎn)物進(jìn)行檢測。用核磁共振波譜儀(Bruker-400MH，德國)檢測得到核磁共振氫譜(1H NMR)圖，根據(jù)譜圖上各種共振峰的位置和強(qiáng)度來表征聚合物的組成和轉(zhuǎn)化率。以單分散聚苯乙烯(PS)為標(biāo)準(zhǔn)物，四氫呋喃(THF)為流動(dòng)相，流速1.00 mL·min-1，柱溫35 °C，通過凝膠滲透色譜儀(PLGPC50，費(fèi)爾伯恩精密儀器(上海)有限公司)測定得到聚合物的分子量及分散性指數(shù)。

2.3 溫度和pH雙重敏感共聚物P(MEO2MAmco-OEGMAn)-b-PDPAp的合成

用無水二氯甲烷做溶劑，在30 °C下用連續(xù)ATRP法合成共聚物。首先，按照上一小節(jié)中的操作合成溫敏共聚物。反應(yīng)12 h后，取單體DPA加入另一個(gè)干燥潔凈的史萊克管中，加入2倍體積的溶劑無水二氯甲烷，冷凍-抽真空-N2保護(hù)下解凍循環(huán)操作三次除氧，在N2保護(hù)下用針管將其轉(zhuǎn)移到溫敏共聚物的反應(yīng)體系中，密封后在30 °C下繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)12 h后，取適量反應(yīng)混合物溶于CDCl3中，用核磁共振波譜儀進(jìn)行檢測，計(jì)算總的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。用相同方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化處理和檢測。

2.4 共聚物的溫度響應(yīng)性測定

稱取適量無規(guī)共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)和嵌段共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp于潔凈的燒杯中，加入適量超純水，攪拌使聚合物溶解，配置成10 mg·mL-1的溶液，放置半小時(shí)。用日本島津公司的UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)檢測聚合物溶液在500 nm處的透光率隨溫度的變化關(guān)系，測試溫度范圍20-70 °C，升溫速率0.1 °C·min-1。同時(shí)，測定聚合物水溶液粒徑隨溫度的變化關(guān)系，將溶液通過孔徑為0.45 μm的水系濾膜過濾除去雜質(zhì)，用英國馬爾文儀器有限公司的Nano-ZS型動(dòng)態(tài)光散射儀來測定溶液中聚集體的粒徑隨溫度的變化曲線，檢測溫度范圍20-70 °C。

2.5 共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp的pH響應(yīng)性測定

稱取適量嵌段共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp于潔凈的燒杯中，加入適量超純水，滴加鹽酸將溶液調(diào)節(jié)至酸性，加速聚合物溶解，配置成10 mg·mL-1的溶液，放置半小時(shí)。將溶液的pH值調(diào)節(jié)為1，然后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH，以0.5-1.0個(gè)pH單位為梯度使其緩慢升高至12。在20 °C下，用UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)檢測不同pH下聚合物溶液在500 nm處的透光率，用Nano-ZS型動(dòng)態(tài)光散射儀來測定不同pH下聚合物溶液中聚集體的粒徑。

2.6 制備聚合物膠束及載藥釋藥研究

用溶劑揮發(fā)法來制備膠束。空白膠束的制備方法如下，將聚合物溶解在THF中配置成10 mg·mL-1的溶液，取其中100 μL，在高速攪拌下逐滴加入2 mL濃度為1 mmol·L-1的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，攪拌12 h至THF完全揮發(fā)。載藥膠束的制備方法基本相同，取250 μL濃度10 mg·mL-1的聚合物的THF溶液，向其中加入25 mg DOX·HCl，和100 μL的三乙胺，然后在高速攪拌下逐滴加入5 mL濃度為1 mmol·L-1的pH 7.4的PBS，攪拌12 h至THF完全揮發(fā)。取0.2 mL混合物，加入0.2 mL pH 1的HCl破壞膠束結(jié)構(gòu)，用1 mmol·L-1的pH 7.4的PBS將其稀釋至5 mL，用紫外-分光光度計(jì)檢測其在485 nm處的吸收值，記作A0。

用濃度為1 mmol·L-1的pH 7.4的PBS做透析液，分子截留量3500的透析袋透析，除去未被包裹的藥物。取0.2 mL載藥膠束，加入0.2 mL pH 1的HCl破壞膠束結(jié)構(gòu)并稀釋至5 mL，將其在485 nm處的吸收值記為A1，則藥物的包封率為(A1/A0) ×100%。藥物釋放實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)備四份1 mL的載藥膠束，將其放置于透析袋中，然后將透析袋浸沒在盛有25 mL pH分別為7.4和5.0的PBS的塑料管中，將塑料管分別置于37和45 °C下震蕩。每小時(shí)取出3 mL PBS，檢測其在485 nm處的吸收值并記作At，然后再返裝回塑料管中。則每個(gè)時(shí)刻下藥物的累積釋放率為(At/A1)×100%。

3 結(jié)果與討論

3.1 共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)的結(jié)構(gòu)表征

本實(shí)驗(yàn)首先用ATRP法合成了1#-6#無規(guī)共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)，在這一系列聚合物中，固定兩種單體的聚合度之和為100，選取不同的MEO2MA和OEGMA摩爾比。圖1為2#產(chǎn)物P(MEO2MA90-co-OEGMA10)的核磁共振氫譜(1H NMR)圖，圖中δ 0.7-1.2處為聚合物主碳鏈上的甲基氫(H，-C-CH3)，δ 1.7-1.9處為主碳鏈上的亞甲基氫(H，-C-CH2-)，δ 3.2-3.4處為側(cè)鏈末端與氧相連的甲基氫(H,-O-CH3)，δ 3.5-3.9處為醚氧鍵之間亞甲基上的氫(H，-O-CH2-CH2-O-)，δ 4.0-4.2處為與酯基相連的亞甲基上的氫(H，-CH2-OOC-)，結(jié)果說明該產(chǎn)物為P(MEO2MA-co-OEGMA)，通過對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算，得到產(chǎn)物中OEGMA的比例為9.89%，并通過GPC檢測得到它的數(shù)均分子量為19946，分散系數(shù)1.31。該系列其它聚合物及其相應(yīng)參數(shù)如表1所示。

圖1 P(MEO2MA90-co-OEGMA10)在CDCl3中的1H NMR圖Fig. 1 The 1H NMR spectrum of P(MEO2MA90-co-OEGMA10) in CDCl3.

從表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，1#-6#所有聚合物的合成中，單體的總體轉(zhuǎn)化率都較高，達(dá)到了95%以上，而且計(jì)算發(fā)現(xiàn)得到的產(chǎn)物中單體OEGMA的含量與投料比都非常接近，說明兩種單體的反應(yīng)活性差別不大。從GPC檢測結(jié)果來看，1#-6#各個(gè)聚合物的分散系數(shù)都較小，在1.25-1.35之間，說明ATRP法可以很好地實(shí)現(xiàn)這兩種單體的可控聚合。

3.2 共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)的溫度敏感性

將各個(gè)聚合物溶于超純水中配制成10 mg·mL-1的溶液，檢測溶液在不同溫度下500 nm處的透光率，結(jié)果如圖2a所示，將溶液透光率下降50%時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度定義為聚合物的LCST。

從圖中可以看出，隨著溫度的升高，聚合物溶液的透光率發(fā)生了很大的變化。溫度較低時(shí)，溶液的透光率為100%，當(dāng)溫度升高到某個(gè)值的時(shí)候，溶液的透光率迅速降低為0。這是因?yàn)榈蜏叵戮酆衔镦溕系拿蜒蹑I與水分子形成氫鍵溶于水，透光率為100%；當(dāng)溫度升高達(dá)到某一個(gè)特定值的時(shí)候，聚合物鏈上的醚氧鍵與水分子形成的氫鍵斷裂，聚合物之間的疏水作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致聚合物溶液的濁度迅速增加，透光率變?yōu)榻?。聚合物溶液濁度發(fā)生突變時(shí)的溫度叫做聚合物的低臨界溶解溫度(LCST)，以透光率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度為聚合物的LCST，則由圖中結(jié)果可知1#-6#的LCST分別為26.5、35.0、40.5、45.5、55.0和93.0 °C (如表1)。此外，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還可以看出，溶液由低溫升到高溫和由高溫降低到低溫的過程中，透射率隨溫度的變化曲線基本重合，無滯后現(xiàn)象，說明該聚合物的溫敏性具有良好的可逆性。

表1 共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)的性質(zhì)參數(shù)Table 1 Properties of the P(MEO2MAm-co-OEGMAn) copolymers.

圖2 (a)聚合物水溶液的透光率隨溫度的變化(實(shí)線：升溫，虛線：降溫)。(b)聚合物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)的LCST與OEGMA單元數(shù)的關(guān)系Fig. 2 (a) The transmittance (500 nm) as a function of temperature of copolymer solutions (10 mg·mL-1).Solid lines: heating, dashed lines: cooling. (b) The measured LCST as a function of the average number of OEGMA units of the copolymers P(MEO2MAm-co-OEGMAn).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚合物的LCST隨著聚合物中OEGMA含量的增大而升高。這是因?yàn)榫酆衔镏蠴EGMA含量增加，側(cè)鏈上醚氧鏈增多，與水分子形成更多的氫鍵，要破壞聚合物分子周圍這種有序的水結(jié)構(gòu)，需要升高溫度來獲得更多的能量，所以聚合物鏈中OEGMA越多，其LCST越高。因此，通過調(diào)節(jié)兩種單體的投料比，可以獲得具有特定LCST的共聚物。我們將聚合物的LCST對(duì)OEGMA單元數(shù)進(jìn)行擬合作圖，發(fā)現(xiàn)呈較好的線性關(guān)系，如圖2b所示。然后根據(jù)擬合得到的函數(shù)關(guān)系設(shè)計(jì)了一個(gè)LCST為38 °C的聚合物7#，計(jì)算得到OEGMA的單元數(shù)為12，按此計(jì)算結(jié)果聚合物合成，并檢測得到聚合物7#的LCST為37.5 °C。說明擬合得到的函數(shù)關(guān)系準(zhǔn)確性較高，可以根據(jù)該函數(shù)關(guān)系設(shè)計(jì)LCST在26.5-45.5 °C之間的任意聚合物。

選擇聚合物2#和4#，配制不同濃度的溶液，用上述方法測出聚合物的LCST，探究LCST與聚合物溶液濃度的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，隨著溶液濃度的升高，所測得的兩種聚合物的LCST均有很小幅度的降低。這是由于隨著聚合物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)濃度的增大，單位體積溶液中聚合物分子數(shù)目增加，醚氧鏈間疏水作用有所增強(qiáng)，所以測得的LCST略有降低。

3.3 共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp的合成

本實(shí)驗(yàn)先用ATRP法，合成了一系列共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)，選取LCST接近37.0 °C的2#和7#，再在反應(yīng)體系中投入第三種單體DPA繼續(xù)反應(yīng)，獲得1*-5*五種共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp，其投料比及相關(guān)性質(zhì)參數(shù)如表2所示。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，前兩種單體整體的轉(zhuǎn)化率高達(dá)97%及以上，投入第三種單體繼續(xù)反應(yīng)后，三種單體的整體轉(zhuǎn)化率也都達(dá)到了95%以上。GPC結(jié)果顯示各個(gè)聚合物的分散系數(shù)都較小，說明用連續(xù)ATRP法可以很好地實(shí)現(xiàn)這種聚合物的有效可控聚合。

圖3 共聚物的LCST與其水溶液濃度的關(guān)系Fig. 3 The measured LCST as a function of the concentration of copolymer solutions.

表2 共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp的性質(zhì)Table 2 Properties of the P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp copolymers.

3.4 共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp的溫度敏感性

將1*-5*聚合物溶于pH 5.0的緩沖液中，配制成10 mg·mL-1的溶液，檢測溶液在不同溫度下500 nm處的透光率，結(jié)果如圖4a所示。與聚合物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)類似，溶液的透光率會(huì)在溫度升高到某個(gè)特定值的時(shí)候迅速由100%降低到0。各個(gè)聚合物的LCST列于表2中。聚合物溶液透光率隨升溫過程的變化曲線與降溫過程的變化曲線基本重合，沒有滯后現(xiàn)象，說明鏈接上PDPA嵌段后聚合物的溫度響應(yīng)性依然非常靈敏。與聚合物P(MEO2MA90-co-OEGMA10)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鏈接了PDPA后，聚合物的LCST升高。這是因?yàn)樵谌跛嵝原h(huán)境下，PDPA段上的氮原子質(zhì)子化，呈較強(qiáng)的親水性，所以整個(gè)聚合物鏈的親水性增強(qiáng)，需要更高的溫度提供更多能量才能破壞聚合物分子與水分子之間的有序結(jié)構(gòu)，聚合物才會(huì)變?yōu)槭杷疇顟B(tài)。

圖4 (a)共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp的溶液的透光率隨溫度的變化(濃度10 mg·mL-1，pH 5.0)。(b)共聚物P(MEO2MA90-co-OEGMA10)-b-PDPAp的LCST與DPA單元數(shù)的關(guān)系Fig. 4 (a) The transmittance (500 nm) as a function of temperature of P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp solutions(pH = 5.0, 10 mg·mL-1). Solid lines: heating cycles; dashed lines: cooling cycles. (b) The measured LCST as a function of the average number of DPA units of the P(MEO2MA90-co-OEGMA10)-b-PDPAp.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚合物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)-b-PDPAp的LCST會(huì)隨著聚合物中DPA含量的增大而升高，對(duì)兩者做相同處理后發(fā)現(xiàn)聚合物的LCST與其中DPA單元數(shù)也呈較好的線性關(guān)系(如圖4b所示)。根據(jù)2*、3*、4*、5*四種聚合物的LCST與DPA單元數(shù)，擬合的直線，設(shè)計(jì)一個(gè)LCST為42 °C左右的聚合物6*。實(shí)驗(yàn)檢測所合成的6*聚合物L(fēng)CST為43 °C，與設(shè)計(jì)結(jié)果相差較小。將新得出的這個(gè)聚合物L(fēng)CST及其DPA單元數(shù)對(duì)應(yīng)的點(diǎn)添加到擬合的曲線圖上，發(fā)現(xiàn)這個(gè)點(diǎn)(紅色點(diǎn))也正好落在所擬合的直線上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，在實(shí)驗(yàn)探究的范圍內(nèi)(聚合物中MEO2MA和OEGMA單元數(shù)為90和10，DPA單元數(shù)在15-30之間)，可以根據(jù)該函數(shù)關(guān)系設(shè)計(jì)LCST在36.5-50.5 °C內(nèi)的任意聚合物且準(zhǔn)確度較高。

3.5 共聚物P(MEO2MA90-co-OEGMA10)-b-PDPAp的pH敏感性

圖5 共聚物P(MEO2MA90-co-OEGMA10)-b-PDPAp的溶液(10 mg·mL-1，25 °C)在 500 nm 處的透光率與 pH 的關(guān)系Fig. 5 The transmittance (500 nm) as a function of pH of P(MEO2MA90-co-OEGMA10)-b-PDPAp solutions(10 mg·mL-1, 25 °C).

將共聚物P(MEO2MA90-co-OEGMA10)-b-PDPAp溶于超純水中，調(diào)節(jié)pH為1，配制成10 mg·mL-1的溶液。然后調(diào)節(jié)溶液的pH，在25 °C下檢測溶液的透光率，結(jié)果如圖5所示。各個(gè)聚合物溶液的透光率和pH的相關(guān)性沒有明顯區(qū)別，當(dāng)pH小于6.3時(shí)，溶液的透光率為較高，在90%以上；當(dāng)溶液的pH達(dá)到6.3，溶液的透光率開始下降，pH增大到7.0的時(shí)候，溶液的透光率均急速降低為35%左右，結(jié)果表明，聚合物中PDPA鏈段的長度對(duì)其pH響應(yīng)行為無明顯影響。圖5中聚合物P(MEO2MA90-co-OEGMA10)-b-PDPAp透光率均在極小的pH范圍(pH 6.3-6.5)里發(fā)生驟變，說明聚合物具有很好的pH敏感性。

3.6 聚合物膠束在不同環(huán)境下的藥物釋放

圖6 聚合物膠束在不同條件下的累積藥物釋放曲線Fig. 6 The cumulative drug release profiles of the micelle under different conditions.

通過用溶劑揮發(fā)法來制備膠束并包裹藥物，包封率約為70%以上，DLS測得膠束的粒徑為(142.6 ±4.2) nm。將載有藥物的膠束放置在不同的環(huán)境下進(jìn)行藥物釋放動(dòng)力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，藥物累積釋放曲線如圖6所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，在不同條件下，膠束的藥物釋放行為有很大差別。在pH 7.4的緩沖液中，37 °C下藥物的累積釋放率約為25%，45 °C下藥物最終的累積釋放率約為5%。在酸性環(huán)境下(pH 5.0)，37 °C時(shí)藥物迅速釋放，4 h左右達(dá)到平衡，并且藥物累積釋放率高達(dá)95%；45 °C時(shí)藥物在前6 h釋放速率較快，累積釋放率達(dá)到了70%，之后藥物的釋放速率變緩，在30 h左右達(dá)到平衡，最終的藥物累積釋放率約為85% (如圖6中右上插圖)，顯示了一個(gè)由快速到緩慢的兩階段釋藥行為。

為了進(jìn)一步探究膠束在不同環(huán)境下釋藥情況差異較大的原因，用DLS檢測了以上幾種環(huán)境下釋藥結(jié)束后膠束的粒徑(見表3)，并用透射電子顯微鏡(TEM)(JEM-1400，日本)檢測了膠束的形貌(見圖7)。與制備膠束時(shí)的環(huán)境條件(室溫約25 °C，pH 7.4)相比，37 °C、pH 7.4的環(huán)境下聚合物膠束的形態(tài)和聚集狀態(tài)沒有發(fā)生明顯變化，因此膠束的粒徑差別不大。而37 °C、pH 5.0下聚合物整體呈親水狀態(tài)，膠束結(jié)構(gòu)難以維持，聚合物分子呈單分散狀態(tài)，所以測得的粒徑很小。當(dāng)溫度升高到45 °C后，膠束外層的親水層變?yōu)槭杷疇顟B(tài)，不論在pH 5.0還是pH 7.4都可能發(fā)生團(tuán)聚，將內(nèi)層結(jié)構(gòu)包裹其中，而且可能形成多個(gè)膠束團(tuán)聚的聚集體，所以膠束粒徑顯著增大。綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為不同環(huán)境下膠束的聚集狀態(tài)如圖8所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠束的物性和釋藥行為與聚合物的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。在室溫(約25 °C)下，pH 7.4的緩沖液中制備膠束并載藥，pH敏感的PDPA段形成疏水內(nèi)核并包裹藥物，溫度敏感的P(MEO2MA90-co-OEGMA10)段呈親水性并構(gòu)成膠束的外層。中性環(huán)境下(pH 7.4)，溫度(37°C)低于聚合物的LCST時(shí)，膠束結(jié)構(gòu)不變，所以泄露量較低；當(dāng)溫度為45 °C時(shí)，膠束外層的聚合物段響應(yīng)溫度變化，由親水性變?yōu)槭杷?，在疏水核心外層聚集，?dǎo)致藥物泄漏量進(jìn)一步降低。然而，在酸性環(huán)境下(pH 5.0)，PDPA變?yōu)橛H水性，與藥物之間的作用力變?nèi)?，藥物可以自由擴(kuò)散，溫度(37 °C)低于聚合物的LCST時(shí)，整個(gè)聚合物鏈呈親水性，膠束解體，所以藥物迅速釋放；溫度為45 °C時(shí)，聚合物膠束外層的溫度響應(yīng)段P(MEO2MA90-co-OEGMA10)由親水變?yōu)槭杷?，可能?huì)逐漸形成更大的聚集體導(dǎo)致藥物釋放率降低。所以在pH 5.0、溫度為45 °C時(shí)，前期藥物快速釋放，然后緩慢釋放，且釋放速率和最終的累積釋放率都較37 °C時(shí)低。結(jié)果表明，將該聚合物制備成膠束作為藥物載體，可以響應(yīng)不同的外界條件的變化達(dá)到藥物快速釋放和緩慢釋放的不同效果。所以該聚合物在藥物載體方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

表3 膠束在不同環(huán)境下的粒徑(單位nm)Table 3 The average diameters of micelles in different conditions.

圖7 膠束在不同環(huán)境下的TEM圖Fig. 7 TEM images of the micelles in different conditions.

圖8 膠束在不同環(huán)境下的聚集狀態(tài)示意圖Fig. 8 Schematic diagram of the aggregation state of micelles in different conditions.

4 結(jié)論

利用ATRP 法，用單體MEO2MA和OEGMA合成了一系列溫度響應(yīng)性無規(guī)共聚物P(MEO2MAm-co-OEGMAn)。聚合物水溶液的相變行為研究結(jié)果表明，聚合物的LCST可以通過調(diào)節(jié)單體的比例進(jìn)行控制，而且在一定的條件下與單體OEGMA的含量成正比。用連續(xù)ATRP法引入第三種單體DPA，合成了pH和溫度雙重響應(yīng)的共聚物P(MEO2MA90-co-OEGMA10)-b-PDPAp，其水溶液的相變行為結(jié)果表明，聚合物的LCST可以通過調(diào)控三種單體的比例來調(diào)節(jié)；此外，聚合物的pH響應(yīng)性幾乎不受單體比例的影響。聚合物膠束的體外模擬釋藥結(jié)果表明，該聚合物膠束能夠較好地包裹藥物，并且可以對(duì)環(huán)境條件的變化及時(shí)做出響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)藥物釋放行為的多樣性。