多肉植物黃麗組培快繁體系的建立

李 博，高明波

（大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

黃麗（Sedum‘Golden Glow’）是景天科景天屬多年生多肉植物，莖短，葉呈肉質(zhì)，排列很緊密，呈蓮座狀，葉片呈匙形。黃麗除了可做盆栽觀賞，還可以治療肝病、尿酸、痛風(fēng)以及高血壓。本試驗選擇黃麗葉片為外植體，通過組織培養(yǎng)技術(shù)建立其快繁體系。已有研究表明，在多肉植物玉扇的組培快繁中，不同外植體的誘導(dǎo)效應(yīng)存在差異，取材是否得當影響組培成功率[1]。劉芳等研究表明，組合為3mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA 和1mg/L KT 的培養(yǎng)基配方能使勞爾葉片愈傷組織誘導(dǎo)率高達95.7%，6-BA 和NAA 對愈傷組織分化芽的效果顯著，3mg/L 6-BA 和0.3mg/L NAA 組合，新芽分化率80%[2]。所以本試驗采用了多肉植物黃麗的不同器官切片作為外植體進行誘導(dǎo)，從而找到最適合組培的切片，并且通過不同濃度的6-BA、NAA 和KT 對外植體進行誘導(dǎo)，從而確立多肉植物黃麗愈傷組織誘導(dǎo)、莖葉分化及生根階段的最佳培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及預(yù)處理

供試多肉植物黃麗為網(wǎng)上購買。試驗試劑：250 gMS 培養(yǎng)基（不含瓊脂和蔗糖），青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；500 g 蔗糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；100g 瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1g 6-芐胺基嘌呤（以下稱6-BA），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；25gα-萘乙酸（以下稱NAA），常州市光明生物化學(xué)研究所；6-糖氨基嘌呤（以下稱KT），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。試驗器材：HVA-85高壓滅菌鍋，HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION；ABS 80-4 分析天平，KERN &Sohn GmbH；SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

將黃麗放入干凈的燒杯中，用自來水沖洗干凈后加入適量洗衣粉，用軟毛刷輕輕刷洗15min，之后倒去洗滌劑，在自來水下沖洗30min 以上。打開紫外線滅菌燈照射消毒超凈工作臺30min，在清潔好超凈工作臺后將黃麗移到超凈工作臺上，先用75%乙醇浸泡30 s，用無菌水沖洗4～5 次，再用0.1%HgCl2（氯化汞）消毒5min，用無菌水沖洗4～5 次。剝?nèi)↑S麗葉片和莖段，挑選狀態(tài)較好的黃麗組織在無菌環(huán)境下切成1cm2左右的小塊，用無菌濾紙吸干多余水分后以備用[3]。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的選擇。外植體選擇時所用基本培養(yǎng)基為：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH 值調(diào)至6.0。分別取黃麗的葉片、莖段2 種不同組織為材料，每種接種5 瓶，每瓶接種3 塊。進行恒溫光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為2000Lx，每日光照12～16h[4]。在5、10、15d 時分別觀察愈傷組織的誘導(dǎo)情況，并測定愈傷組織的大小。

1.2.2 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的選擇。誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，分別添加0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L 的KT、6-BA[5]。以黃麗的葉片或莖段部分組織為外植體進行接種，每種接種5 瓶，每瓶接種3 塊。進行恒溫光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為2000Lx，每日光照12～16h。在5、10、15 d 時觀察外植體的生長情況，并測定愈傷組織的大小。

1.2.3 誘導(dǎo)分化生莖培養(yǎng)基的選擇。誘導(dǎo)分化生莖的基本培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，分別添加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L 的6-BA[5]。進行恒溫光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為2000Lx，每日光照12～16h。在5、15、30 d 時觀察愈傷組織的變化情況以及誘導(dǎo)莖葉生長情況，并測定莖葉的大小。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的選擇。生根的基本培養(yǎng)基為：MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂，分別添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L 的NAA[5]。對上一階段誘導(dǎo)出的已分化的莖葉植株進行生根培養(yǎng)。進行恒溫光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為2000Lx，每日光照12～16h。在5、15、30 d 時觀察愈傷組織的變化情況以及根的生長情況并測定根的大小。

1.3 測定方法

在無菌的條件下，使用直尺測量愈傷組織，莖葉以及根的大小。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

使用Excel 等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理與分析。數(shù)據(jù)用平均值表示。結(jié)果用三線表整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同器官切片對愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

本試驗利用多肉植物黃麗的器官葉片、莖段的橫縱切片分別作為試驗材料，選擇最適合做組培快繁的材料。橫切為沿著較短長度方向切割，縱切為沿著較長長度方向切割。

表1 不同器官切片對愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

由試驗結(jié)果可知，黃麗的莖段橫縱切片均不可作為外植體進行組培，葉片的縱切片也不合適，葉片的橫切片脹大呈淡黃色，結(jié)構(gòu)較為緊密，還可以觀察到外植體的大致形狀，且外植體的長度明顯長于其他組織，即誘導(dǎo)愈傷組織的效應(yīng)明顯優(yōu)于其它部分。

2.2 不同激素濃度對黃麗組培各階段的影響

2.2.1 不同濃度KT、6-BA 對外植體的影響。由試驗結(jié)果可知，經(jīng)過不同濃度激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，不同濃度的激素對外植體的誘導(dǎo)率相同，都為100%，即不同濃度的KT、6-BA 均能誘導(dǎo)黃麗外植體形成愈傷組織，但誘導(dǎo)效果有很大差別，外植體長度明顯高于對照組。誘導(dǎo)培養(yǎng)5d 后外植體無明顯變化，誘導(dǎo)培養(yǎng)10d 后愈傷組織呈顆粒狀聚集，表明愈傷組織一般在誘導(dǎo)培養(yǎng)后10d 左右產(chǎn)生，愈傷組織數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而逐漸增加。比較了不同濃度KT、6-BA 的誘導(dǎo)效果，6-BA 最佳濃度的誘導(dǎo)效果比KT最佳濃度的誘導(dǎo)效果好。愈傷組織誘導(dǎo)效果最好為6-BA 濃度為1mg/L 時，誘導(dǎo)培養(yǎng)15d 后，外植體長度可達1.05cm，明顯高于其他濃度的6-BA

表2 不同濃度KT、6-BA 影響下外植體的長度 單位：cm

2.2.2 不同濃度6-BA 對葉片組織的影響。由試驗結(jié)果可得，隨著時間增長不同濃度6-BA 條件下的葉片組織均有增長，其中5d 時誘導(dǎo)效果都不明顯，15d 時除了6-BA 濃度為0.5mg/L 的一組，其他組都有變化，到30 d 時誘導(dǎo)效果與對照組相比均有顯著變化，但增長程度不同，隨著6-BA 的濃度增大，誘導(dǎo)效果逐漸明顯，當6-BA 濃度為2mg/L 時，葉組織的誘導(dǎo)效果最好，產(chǎn)生叢生芽。

表3 不同濃度6-BA 影響下葉片組織的高度 單位：cm

2.2.3 不同濃度NAA 對根組織的影響。由試驗結(jié)果可得，經(jīng)不同濃度NAA 誘導(dǎo)黃麗葉片組織分化生根，除0.5mg/L 濃度的NAA 環(huán)境下，其余隨著時間增加不同濃度NAA 條件下的根系均有增長，其中5d 時誘導(dǎo)效果都不明顯，15d 時除了NAA 濃度為0.5 mg/L 的一組，其他組都有變化，到30d 時誘導(dǎo)生根效果有顯著變化，但增長程度不同，隨著6-BA 的濃度增大，誘導(dǎo)效果逐漸減弱，當濃度達到0.5mg/LNAA 時不再誘導(dǎo)生根，當NAA 濃度為0.1mg/L 時，誘導(dǎo)生根效果最佳，根系長度明顯高于對照組及其它濃度試驗組。

表4 不同濃度NAA 影響下根組織的長度 單位：cm

3 討論

該試驗首先以黃麗的葉片和莖部的橫縱切片為外植體，篩選適合作為外植體的組織，通過試驗得到了葉片橫切片是最合適作為外植體的結(jié)論，其他切片均不合適，不適宜產(chǎn)生愈傷組織。以葉片橫切片為外植體，通過3 組試驗確定了黃麗愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為：MS+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂+1mg/L 6-BA；誘導(dǎo)分化生莖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂+2mg/L 6-B 誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1mg/L NAA。采用該試驗愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，大約10d 就有愈傷組織產(chǎn)生，1d 能夠得到較為明顯的愈傷組織，再采用誘導(dǎo)生莖培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)15d 可獲得叢生芽，之后采用該試驗的生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)5d 即可有根系產(chǎn)生，再培養(yǎng)10d 就可形成完整植株，所以采用本試驗的最佳培養(yǎng)基配方進行黃麗組織培養(yǎng)，不到2 個月即可獲得完整植株。綜上所述，該研究得到了黃麗組織培養(yǎng)的最佳外植體及各培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基配方，建立了多肉植物黃麗的組培快繁技術(shù)體系，研究結(jié)果能有效提高愈傷組織誘導(dǎo)成功率、縮短種苗生產(chǎn)周期，為黃麗的工廠化育苗提供了試驗依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。