趙瑋 郭龍宗 張孝蘭 李燕 石海春 王雪梅 侯珍珍

中圖分類號：S858.31???? 文獻標識碼：C???? 文章編號：1673-1085（2020）3-0046-03

沙門氏菌病為人畜共患病，在食品安全及公共衛(wèi)生上極為重要。沙門氏菌無處不在，廣泛分布于各種動物和環(huán)境中。沙門氏菌可存在于雞群中，但并不一定引起發(fā)病，在雞群受到應(yīng)激或垂直傳播時可引起種雞或雛雞發(fā)病。沙門氏菌抵抗力較強，在環(huán)境中可長期存活，在蛋殼表面可存活200d，在塵埃中可存活3年之久，對陽性雞舍進行徹底消毒十分困難。所以在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，對雞群生長環(huán)境進行沙門氏菌檢測尤為重要，本文就針對怎樣有效的從污染物中分離沙門氏菌以及選用什么樣的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)沙門氏菌做了一系列的實驗，供大家參考。

1? 實驗原理、方法

1.1? 我們首先將容易干擾沙門氏菌生長的革蘭氏陰性細菌（大腸桿菌、變形桿菌）與沙門氏菌接種到不同的培養(yǎng)基，再將常見的不同血清的沙門氏菌接種到不同培養(yǎng)基，觀察其生長形態(tài)，結(jié)合兩組實驗結(jié)果選擇培養(yǎng)基的優(yōu)勢組合來有效的鑒別沙門氏菌。

1.2? 由于環(huán)境中存在的大多數(shù)沙門氏菌為腸炎型的沙門氏菌，通過添加少量腸炎型沙門氏菌，人工模擬雞舍內(nèi)沙門氏菌陽性的墊料，用不同的增菌液增菌，再傳代到沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基，依據(jù)從污染物中檢出沙門氏菌的結(jié)果，選擇優(yōu)勢的增菌液與鑒別培養(yǎng)基。

2? 實驗試劑、材料

2.1? 實驗試劑? 普通營養(yǎng)瓊脂，麥康凱瓊脂，SS瓊脂，亮綠瓊脂（BG），DHL瓊脂，XLD瓊脂，XLT4瓊脂，緩沖蛋白胨水（BPW），亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC），氯化鎂孔雀綠增菌液（MM），液體連四硫酸鹽（USP）（FTM）帶有配套試劑碘液和煌綠，以上試劑均購買自青島海博生物有限公司，沙門氏菌單因子診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，生理鹽水、蒸餾水。

2.2? 實驗材料? 腸炎型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、變形桿菌（均為已鑒定的純化菌株），木花、稻殼（沙門氏菌陰性），雞糞（沙門氏菌陰性），移液器（20～200μL、100～1000μL），吸頭（200μL、1000μL），接種針，酒精燈，三角燒瓶，平口試管帶試管塞，平皿。

3? 實驗步驟

3.1? 鑒別培養(yǎng)基的選擇

3.1.1? 制備瓊脂平板：按照產(chǎn)品說明將普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、BG瓊脂、DHL瓊脂、XLD瓊脂、XLT4瓊脂制備成瓊脂平板。

3.1.2? 將大腸桿菌、變形桿菌、腸炎型沙門氏菌的純化的菌株傳代于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、亮綠瓊脂、DHL瓊脂、XLD瓊脂、XLT4瓊脂、倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。

3.1.3? 菌株在不同培養(yǎng)基的鑒別結(jié)果見圖1。

由圖1可見，普通營養(yǎng)瓊脂可以區(qū)分變形桿菌與腸炎型沙門氏菌，但不宜區(qū)分大腸桿菌與腸炎型沙門氏菌;DHL瓊脂、麥康凱瓊脂可以區(qū)分大腸桿菌與腸炎型沙門氏菌，但不宜區(qū)分變形桿菌與腸炎型沙門氏菌;亮綠瓊脂不宜區(qū)分大腸桿菌、腸炎型沙門氏菌、變形桿菌;SS、XLD、XLT4可以明顯的區(qū)分大腸桿菌、腸炎型沙門氏菌、變形桿菌。

3.1.4? 將雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎型沙門氏菌分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、XLT4瓊脂，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出：普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱、XLT4可以區(qū)分雞白痢沙門氏菌與腸炎型沙門氏菌，XLT4可以區(qū)分雞白痢沙門氏菌、腸炎型沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌。

由以上結(jié)果可以看出，在分離培養(yǎng)沙門氏菌時可以選用普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、XLT4瓊脂、麥康凱瓊脂組合，這樣可以快速有效地發(fā)現(xiàn)沙門氏菌的可疑菌落。

3.2? 增菌液的選擇

3.2.1? 菌液制備? 將純化的腸炎型沙門氏菌涂于平板37℃溫箱培養(yǎng)24h，用生理鹽水稀釋，用平板點樣計數(shù)法調(diào)菌液濃度為102、103CFU/mL。

3.2.2? 墊料的制備? Ⅰ組只將木花和稻殼混合不加雞糞;Ⅱ組將木花、稻殼、雞糞混合均勻，模擬雞舍內(nèi)墊料。

3.2.3? 制備增菌液及平板? 按照說明分別配制緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）、液體連四硫酸鹽（USP）（FTM），滅菌分裝備用，以下以BPW、SC、MM、FTM代替增菌液名稱;將普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、XLT4瓊脂制備成瓊脂平板備用。

3.2.4? 實驗分組? A組選用BPW為前增菌液，SC、MM、FTM增菌液，分別標記為A-SC、A-MM、A-FTM;B組SC為前增菌液，SC為增菌液;C組MM為前增菌液，MM為增菌液;D組FTM為前增菌液，F(xiàn)TM為增菌液，A～D組分別再做添加不同量沙門氏菌菌液的三組對比，即不添加沙門氏菌菌液、添加100μL 102CFU/mL沙門氏菌菌液、添加100μL 103CFU/mL沙門氏菌菌液。

3.2.5? 實驗方法、步驟（無菌操作）

3.2.5.1? 準確稱量25gⅠ組墊料加到225ml的BPW、SC、MM、FTM前增菌液中混勻，A組前增菌液做六個重復(fù)，即A1-SC、A1-MM、A1-FTM、A2-SC、A2-MM、A2-FTM、A3-SC、A3-MM、A3-FTM;B、C、D組前增菌液做三個重復(fù)，即B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3;準確稱量25gⅡ組墊料加到225ml的BPW、SC、MM、FTM前增菌液中混勻，A組前增菌液做六個重復(fù)，即A1'-SC、A1'-MM、A1'-FTM、A2'-SC、A2'-MM、A2'-FTM、A3'-SC、A3'-MM、A3'-FTM;B、C、D組前增菌液做三個重復(fù)，即B1'、B2'、B3'，C1'、C2'、C3'，D1'、D2'、D3'。

3.2.5.2? A1-SC、A1-MM、A1-FTM、B1、C1、D1、A1'-SC、A1'-MM、A1'-FTM、B1'C1'D1'前增菌培養(yǎng)中不添加沙門氏菌菌液;吸取100μL 102CFU/mL沙門氏菌菌液添加到A2-SC、A2-MM、A2-FTM、B2、C2、D2、A2'-SC、A2'-MM、A2'-FTM、B2'、C2'、D2'的前增菌液中搖勻;吸取100μL 103CFU/mL沙門氏菌菌液添加到A3-SC、A3-MM、A3-FTM、B3、C3、D3、A3'-SC、A3'-MM、A3'-FTM、B3'、C3'、D3'的前增菌液中搖勻，37℃溫箱培養(yǎng)24h。

3.2.5.3? 培養(yǎng)后產(chǎn)物增菌：取前增菌培養(yǎng)物1mL加入9ml相對應(yīng)的增菌液中37℃溫箱培養(yǎng)24h。

3.2.5.4? 培養(yǎng)基平板傳代：用接種針取增菌培養(yǎng)物一環(huán)劃線于培養(yǎng)基平板，分別為普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、XLT4瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h。

3.2.6? 培養(yǎng)結(jié)果? 見表1。

3.2.7? 結(jié)果判定? 將分離到的可疑沙門氏菌純化傳代，進行單因子診斷血清凝集實驗，凝集A-F多價血清，凝集O9、O12、Hg、Hm，診斷為腸炎型沙門氏菌。

由以上實驗可以看出BPW前增菌液對沙門氏菌的選擇性不高，當樣品被大量其他細菌污染、沙門氏菌含量較少不是優(yōu)勢菌群時，沙門氏菌不宜分離到，F(xiàn)TM對沙門氏菌的增菌效果要好于SC，MM增菌效果比SC差，所以對污染物進行沙門氏菌分離時用FTM兩次增菌效果較好，能快速有效的分離沙門氏菌。

4? 結(jié)論

對雞群環(huán)境進行沙門氏菌檢測是對雞群健康監(jiān)控的有效手段，選用合適的培養(yǎng)基可確保我們的實驗結(jié)果準確。由以上實驗可以看出，樣品較為干凈、雜菌較少時，可用BPW進行前增菌，SC或MM或FTM增菌，再結(jié)合普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱、XLT4的有效組合可以有效分離沙門氏菌，當樣品較臟、雜菌較多而沙門氏菌含量較少不是優(yōu)勢菌群時，用FTM兩次增菌，再結(jié)合普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱、XLT4組合效果較好，能快速有效的分離沙門氏菌?！?/p>

收稿日期：2020-03-20