劉夢楠 王 會(huì) 戚孟春 董 偉 李 任 孫 紅

破骨細(xì)胞在分化成熟過程中受一系列細(xì)胞因子調(diào)控[1-3]，許多骨過度吸收性疾病都與其活性改變及生成數(shù)目異常有關(guān)[4]。因此，如何抑制由破骨細(xì)胞參與的骨吸收過程是治療這些疾病的有效途徑。CaMKII是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶CaMKs的重要成員，是Ca2+/Calmodulin的重要靶位點(diǎn)[5]，有α，β，δ，γ四個(gè)不同的異構(gòu)體[6-7]，其中CaMKIIδ和γ高度表達(dá)于破骨細(xì)胞分化中，且作用較為關(guān)鍵[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)CaMKIIδ RNAi顯著抑制破骨細(xì)胞生成[9-10]，然而CaMKIIγ如何在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮作用，國內(nèi)外尚無報(bào)道。Ca2+/鈣調(diào)蛋白/NFATc1信號傳導(dǎo)途徑是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和骨吸收的重要信號傳導(dǎo)途徑[11-12]。在外界刺激下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+與CaMKs結(jié)合，調(diào)控下游NFATc1、TRAP、c-Src等相關(guān)基因表達(dá)，從而影響破骨細(xì)胞分化成熟及骨質(zhì)吸收[11-13]。故本研究通過RNAi技術(shù)，檢測CaMKIIγ對細(xì)胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src基因表達(dá)的影響，進(jìn)而探討其在破骨細(xì)胞分化成熟過程中的作用，為骨吸收性疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 方法

1.1 分組

運(yùn)用慢病毒構(gòu)建CaMKIIγ重組干擾載體，委托上海吉?jiǎng)P基因公司完成。RAW264.7細(xì)胞分為A、B、C三組，A組為對照組，未用病毒轉(zhuǎn)染；B組用陰性載體病毒轉(zhuǎn)染；C組用重組干擾載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

RAW264.7細(xì)胞以5×103/孔的密度接種到30 mm直徑的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染12 h后，用含50 ng/mL RANKL的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化；隔天換液，于誘導(dǎo)5天后收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NFATc1、TRAP、c-Src基因mRNA水平

用Trizol法提取三組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR將三組逆轉(zhuǎn)錄的cDNA和待測基因引物[5]按TaRaKa擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，以管家基因β-actin(肌動(dòng)蛋白)作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：首先95℃ 30 s；然后95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)；檢測NFATc1、TRAP、c-Src及β-actin的mRNA表達(dá)情況；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值表示mRNA相對表達(dá)水平。

1.3 蛋白印跡法檢測NFATc1、TRAP、c-Src蛋白水平

將蛋白酶抑制劑與RIPA裂解液在冰上預(yù)冷配制，提取各組總蛋白，檢測蛋白濃度，上樣配制；蛋白100℃煮沸變性5 min，制取凝膠，電泳電轉(zhuǎn)以后抗體孵育；TBST盒內(nèi)輕搖洗滌3次，每次10 min，ECL顯色試劑盒顯影；用Amersham Imager600凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以β-actin條帶灰度值作為參照，測量計(jì)算待測基因條帶灰度值；每組重復(fù)3次。

1.4 免疫熒光化學(xué)檢測NFATc1、TRAP、c-SRc蛋白表達(dá)及破骨細(xì)胞生成

用4%多聚甲醛溶液固定各組細(xì)胞，PBS洗滌3次，每次15 s。山羊血清封閉20 min，孵育抗體，使用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記和碘化丙錠(Propylene iodide，PI)標(biāo)記。激光共聚焦顯微鏡下600倍觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組定量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，多組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NFATc1、TRAP、c-Src基因mRNA水平分析

經(jīng)Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀檢測，A組、B組和C組中NFATc1、TRAP、c-Src與管家基因β-actin的mRNA均有表達(dá)。C組NFATc1、TRAP、c-Src mRNA的相對表達(dá)量分別為0.52±0.04(P<0.001)、0.59±0.02(P<0.001)和0.52±0.02(P<0.001)，較A組分別下降了49.86%、43.65%和53.57%；B組與A組間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1)。上述結(jié)果表明，CaMKIIγ RAN干擾可顯著抑制破骨細(xì)胞分化成熟中NFATc1、TRAP、c-Src基因的mRNA水平。

2.2 蛋白印跡法檢測NFATc1、TRAP、c-Src蛋白水平

A組與B組蛋白條帶相似，染色較強(qiáng)；而C組蛋白條帶染色明顯弱于A、B組。定量分析表明，C組NFATc1、TRAP、c-Src蛋白條帶相對光密度值顯著低于A組，較A組分別下降54.22%(P<0.001)、46.75%(P<0.001)和45.86%(P<0.001)；而A組與B組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖2)。上述結(jié)果說明，CaMKIIγ RNA干擾抑制了破骨細(xì)胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src蛋白的表達(dá)。

2.3 免疫熒光化學(xué)檢測NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表達(dá)及破骨細(xì)胞生成

C組多核破骨細(xì)胞(胞核≥3個(gè))生成較少，體積較小；且NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表達(dá)較弱，熒光較淺，胞核內(nèi)均未見表達(dá)。而A組、B組多核破骨細(xì)胞生成較多，體積較大；蛋白表達(dá)較強(qiáng)，熒光較亮；其中NFATc1在胞漿胞核內(nèi)均有表達(dá)，而TRAP、c-Src主要分布在胞漿(圖3-5)。上述結(jié)果提示，CaMKIIγ RNA干擾顯著抑制了破骨細(xì)胞生成，并降低其內(nèi)NFATc1、TRAP、c-Src蛋白水平，抑制NFATc1蛋白活性。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NFATc1、TRAP、c-Src基因mRNA水平(n=3)Figure 1 The levels of NFATc1，TRAP and c-Src mRNA in osteoclasts by Real-time PCR(n=3)Note：A.The expression of NFATc1 mRNA；B.The expression of TRAP mRNA；C.The expression of c-Src mRNA in osteoclasts.* P<0.05，when compared with the A group.

圖2 蛋白質(zhì)印記法檢測三組細(xì)胞NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表達(dá)(n=3)Figure 2 The expression of NFATc1，TRAP and c-Src protein in osteoclasts by Western blot(n=3)Note：A.The expression of NFATc1 protein；B.The expression of TRAP protein；C.The expression of c-Src protein in in osteoclasts.* P<0.05，when compared with the A group.

3 討論

骨質(zhì)疏松、牙周炎、種植體周圍炎等骨吸收性疾病都與破骨細(xì)胞分化和活性異常增高有關(guān)。在CaMKs中，CaMKII和CaMKIV與破骨細(xì)胞生成有關(guān)；有研究已經(jīng)證明了CaMKIV的作用[9]，但CaMKII對破骨細(xì)胞生成過程中的調(diào)控作用尚未明確證實(shí)，且CaMKII中CaMKIIγ的作用機(jī)制，目前國內(nèi)外也少有報(bào)道。

破骨細(xì)胞前體在RANKL等因子的刺激下，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生Ca2+離子震蕩，Ca2+與Calmodulin結(jié)合，從而分別激活CaMKs和鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin)兩個(gè)信號分子；二者又以不同方式調(diào)控下游的NFATc1基因表達(dá)和蛋白活性，繼而影響破骨細(xì)胞分化及骨吸收。CaMKII是Calmodulin下游傳遞Ca2+信號的重要分子，參與破骨細(xì)胞分化調(diào)控，其結(jié)構(gòu)域包含可變結(jié)構(gòu)域，自我抑制結(jié)構(gòu)域，相關(guān)結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域[14]?？勺冇蚝拖嚓P(guān)域之間的差異產(chǎn)生CaMKIIα，β，δ，γ四種不同的亞型[15]。國外學(xué)者證實(shí)，在破骨細(xì)胞分化的不同階段，四種亞型的表達(dá)水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明它們可能在細(xì)胞分化中發(fā)揮不同作用[3，8，16]。我們前期發(fā)現(xiàn)，在α、β、δ、γ四個(gè)異構(gòu)體中，CaMKIIδ和γ在破骨細(xì)胞分化中表達(dá)較高[8-10]，證明其作用較為關(guān)鍵；CaMKIIδ基因沉默可顯著抑制破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能，并下調(diào)NFATc1、TRAP、c-Src基因表達(dá)[17]，進(jìn)一步證明了CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中的關(guān)鍵作用。然而，CaMKIIγ是否與CaMKIIδ發(fā)揮著相似的作用目前尚不清楚。為此，本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)探索CaMKIIγ基因沉默對破骨細(xì)胞分化的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaMKIIγ RNA干擾顯著下調(diào)了NFATc1、TRAP、c-Src基因表達(dá)，使其mRNA水平分別下降了49.86%、43.65%和53.57%，蛋白水平分別下降54.22%、46.75%和45.86%。同時(shí)，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，RNA干擾也顯著抑制了破骨細(xì)胞生成，使之?dāng)?shù)目變少，體積變小。上述結(jié)果說明，CaMKIIγ與CaMKIIδ相同，都在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

NFATc1是Ca2+信號下游調(diào)控破骨細(xì)胞分化和骨吸收的主要調(diào)節(jié)因子(Master regulator)，參與許多破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的調(diào)控，在破骨細(xì)胞融合、黏附、遷移、酸化及骨有機(jī)基質(zhì)降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11-12，18-19]。NFATc1表達(dá)異常會(huì)引發(fā)破骨細(xì)胞生成及功能嚴(yán)重障礙，發(fā)生骨硬化癥[18-19]。本研究中CaMKIIγ基因沉默后，NFATc1基因表達(dá)顯著減少，同時(shí)破骨細(xì)胞的生成也受到明顯抑制，從而說明CaMKIIγ對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控是通過影響NFATc1基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。另外，NFATc1在上游信號作用下需要在胞漿內(nèi)脫磷酸而活化，進(jìn)而異位進(jìn)入胞核參與破骨細(xì)胞特異基因的表達(dá)調(diào)控[11-12，18-19]。本研究中RNA干擾組胞核內(nèi)未觀察到活化的NFATc1，而另外兩組胞核內(nèi)則有高水平的NFATc1存在，說明CaMKIIγ不僅通過影響NFATc1基因表達(dá)，還通過影響其蛋白活性來發(fā)揮對破骨細(xì)胞分化調(diào)控作用。

c-Src屬于非受體酪氨酸激酶家族成員,可以通過使信號蛋白磷酸化或是作為適配體連接其它信號蛋白來發(fā)揮作用[20]。c-Src基因敲除的破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架異常，無法形成正常偽足，細(xì)胞移動(dòng)及皺褶緣形成也出現(xiàn)異常，阻礙了其骨吸收活性，導(dǎo)致骨硬化癥[21-22]。研究還發(fā)現(xiàn)，RANKL與破骨細(xì)胞表面受體RANK結(jié)合后，募集胞內(nèi)適配分子腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAP6)，TRAP6可與胞內(nèi)c-Src形成信號復(fù)合物，并增強(qiáng)c-Src激酶活性，繼之激活A(yù)kt/PKB途徑，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成與分化[23]。本研究中CaMKIIγ RNA干擾顯著抑制了c-Src基因表達(dá)，說明c-Src可能參與了CaMKIIγ對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控，Ca2+信號通路通過c-Src與Akt/PKB信號發(fā)生了交叉。

圖3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測NFATc1在破骨細(xì)胞中的表達(dá)(LSCM，×600)Figure 3 Detection of NFATc1 expression in osteoclasts by immunofluorescent cytochemistry(LSCM，×600)Note：The NFATc1 gene is labeled with FITC and the nucleus is labeled with PI.Group A and group B have more multinucleated osteoclasts，stronger protein expression and brighter fluorescence.Group C multinucleated osteoclasts are less produced and smaller in size.

圖4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測TRAP在破骨細(xì)胞中的表達(dá)(LSCM，×600)Figure 4 Detection of TRAP expression in osteoclasts by immunoflurescence cytochemistry(LSCM，×600)Note：The TRAP gene is labeled with FITC and the nucleus is labeled with PI.Group A and group B have more multinucleated osteoclasts，stronger protein expression and brighter fluorescence.Group C multinucleated osteoclasts are less produced and smaller in size.

圖5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測c-Src在破骨細(xì)胞中的表達(dá)(LSCM，×600)Figure 5 Detection of c-Src expression in osteoclasts by immunoflurescence cytochemistry(LSCM，×600)Note：The c-Src gene is labeled with FITC and the nucleus is labeled with PI.Group A and group B have more multinucleated osteoclasts，stronger protein expression and brighter fluorescence.Group C multinucleated osteoclasts are less produced and smaller in size.

TRAP是破骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白之一，在分化階段及成熟破骨細(xì)胞中均高表達(dá)，并在骨吸收中發(fā)揮重要作用。該基因由Acp5基因編碼，Acp5基因缺陷小鼠表現(xiàn)為中度骨硬化癥[24]。TRAP主要存在于破骨細(xì)胞的溶酶體中，參與骨基質(zhì)的降解；也被釋放進(jìn)入骨吸收陷窩，使骨橋蛋白去磷酸化，促進(jìn)破骨細(xì)胞遷移[25-26]。本研究中CaMKIIγ RNA干擾顯著抑制了TRAP基因表達(dá)，說明CaMKIIγ對破骨細(xì)胞的調(diào)控與TRAP密切相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)對CaMKIIγ進(jìn)行基因沉默，顯著下調(diào)了NFATc1、TRAP、c-Src基因表達(dá)，并抑制了破骨細(xì)胞生成；提示CaMKIIγ對破骨細(xì)胞分化發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，而NFATc1、TRAP、c-Src參與了CaMKIIγ對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控。