miR-362靶向Six1抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的作用機(jī)制研究

李 景 吳華珍 劉繼瑣

宮頸癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，占全球人類(lèi)癌癥的12%。據(jù)估計(jì)，在2015年全球有56萬(wàn)例新發(fā)病例和29萬(wàn)例宮頸癌死亡病例[1-3]。宮頸癌患者局部晚期疾病和轉(zhuǎn)移性疾病的5年總生存率分別為30%～50%和5%～15%[4-5]。miR-362通過(guò)直接靶向Gli3發(fā)揮其抗增殖功能，并通過(guò)在體外和體內(nèi)抑制宮頸癌生長(zhǎng)而起到腫瘤抑制劑的作用[6-8]。miR-362參與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的調(diào)節(jié)，以在體外和體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。Six1是Six家族的同源域的成員，位于人類(lèi)染色體14q23(34)上[9]。Six1在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和血管生成中起重要作用[10]。此外，據(jù)報(bào)道Six1受miRNA調(diào)節(jié)，例如肺癌中的miR-134和急性髓性白血病中的miR-370。本研究擬探討miR-362靶向Six1抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的作用機(jī)制，為宮頸癌的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2012年4月—2013年8月在我院行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的宮頸癌患者142例為宮頸癌組，獲得宮頸癌組織和配對(duì)的癌旁組織(離腫瘤3 cm，病理未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞)，將其儲(chǔ)存在-80℃冰箱，直至進(jìn)行RNA提取。該研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意。

1.2 宮頸癌組織及癌旁正常組織miR-362表達(dá)水平測(cè)定

使用TRIzol試劑按照制造商的說(shuō)明從組織或細(xì)胞中提取總RNA。使用Applied Biosystems 7900HT RT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)。為了量化miR-362的表達(dá)，使用以下方法合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄，然后用TaqMan MicroRNA PCR Kit進(jìn)行qPCR。研究中使用的引物如下：miR-362：5′-ACACTCCAGCTGGGCTCCTATATGATGC-3′，5′-ACTCCACGACACCAGTTGAG-3′。U6：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。U6用作miR-362 mRNA表達(dá)的內(nèi)源對(duì)照。用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-362的相對(duì)水平。

1.3 Hela細(xì)胞培養(yǎng)及分組設(shè)計(jì)

宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心(中國(guó)上海)，在Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)，加入10%胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素；所有細(xì)胞在37℃含有5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

分組設(shè)計(jì)：Hela宮頸癌組：取5×106Hela宮頸癌細(xì)胞于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、20% O2)；miR-362mimics、miR-362 inhibitor組：取10 mL轉(zhuǎn)染miR-362 mimics、miR-362inhibitor的Hela宮頸癌細(xì)胞液于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、2% O2)。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)72 h。

Hela宮頸癌細(xì)胞株miR-362mimics、miR-362inhibitor轉(zhuǎn)染：取5×106Hela宮頸癌細(xì)胞液接種于6孔板，細(xì)胞長(zhǎng)到60%～70%匯合的密度時(shí)，用Lipofectamine 2000試劑按照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟如下：取100pmol的miR-362mimics、miR-362inhibitor于200 μL DMEM培養(yǎng)基中，取4 μL lipofectamine2000于200 μL DMEM培養(yǎng)基中，混勻lipofectamine2000和miRNA液，室溫培育30 min，無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞，將混合液加入細(xì)胞孔內(nèi)，6 h后棄混合液，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后約24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效情況。miR-362mimics、miR-362inhibitor獲自上海藍(lán)基因生物科技有限公司。

1.4 癌細(xì)胞活力的MTT法檢測(cè)及癌細(xì)胞單克隆形成數(shù)目檢測(cè)

通過(guò)使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)測(cè)定來(lái)評(píng)估細(xì)胞增殖。收集轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞并以每孔2，000個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中。然后將細(xì)胞在37℃下在含有5%CO2和100%濕度的條件下孵育72 h。向每個(gè)孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，隨后在37℃下再孵育4 h。小心丟棄含有MTT溶液的培養(yǎng)基，并加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)以溶解甲crystals沉淀物。使用自動(dòng)多孔分光光度計(jì)(Bio-Rad)測(cè)量490 nm處的光密度(OD)值。

1.5 癌細(xì)胞單克隆形成數(shù)目檢測(cè)

轉(zhuǎn)染24 h后，將各組細(xì)胞用胰蛋白酶處理，計(jì)數(shù)，并以密度為1 000個(gè)細(xì)胞/孔在6孔板中接種用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)8天。每3天更換培養(yǎng)基以維持細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)8天后，將菌落固定并用0.5%結(jié)晶紫在室溫下染色30 min。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.6 癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)

通過(guò)使用膜聯(lián)蛋白V/熒光素異硫氰酸酯(FITC)細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將在6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，洗滌，在黑暗中用FITC綴合的抗膜聯(lián)蛋白V抗體染色。在室溫下15 min，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(BD Biosciences)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。使用FACS Calibur系統(tǒng)測(cè)試標(biāo)記的各組細(xì)胞，并測(cè)定凋亡百分比及細(xì)胞周期。

1.7 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

收獲轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，用無(wú)FBS DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，然后重懸于無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基中。將總共1×105個(gè)細(xì)胞加入到涂有Matrigel的Transwell培養(yǎng)板的上室中。將含有20%FBS的約600 μL DMEM加入Transwell培養(yǎng)板的下室中。在37℃和5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中孵育48 h后，用棉簽小心地除去殘留在膜上表面的細(xì)胞。滲透到膜下表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，用0.5%結(jié)晶紫染色，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，并在空氣中干燥。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)侵入的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 Hela宮頸癌細(xì)胞iR-362、Six1 mRNA水平測(cè)定

實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各組miR-362、Six1 mRNA表達(dá)水平。Six1正向引物：5′-GTTAGCCTTGTCTTTACT-3′，反向引物：5′-ACTGCTACTGTTCGACAGAATCG-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織、宮頸癌組織中miR-362mRNA表達(dá)水平的比較

宮頸癌組織miR-362mRNA表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05)(表1)。

表1 癌旁組織、宮頸癌組織中miR-362mRNA水平的表達(dá)

2.2 miR-362表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

以宮頸癌組miR-362 mRNA中位數(shù)0.94為判定點(diǎn)，<0.94為低表達(dá)，≥0.94為高表達(dá)；有淋巴血管間隙浸潤(rùn)、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度越深時(shí)，miR-362mRNA表達(dá)率越低，miR-362表達(dá)與淋巴血管間隙浸潤(rùn)、病理學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05)(表2)。

2.3 各組Hela癌細(xì)胞OD值、存活率水平的表達(dá)

miR-362mimics組OD值、存活率水平低于Hela癌細(xì)胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組OD值、存活率水平高于Hela癌細(xì)胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(表3)。

2.4 各組Hela癌細(xì)胞單克隆形成數(shù)目的表達(dá)

miR-362mimics組克隆形成數(shù)目低于Hela癌細(xì)胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組克隆形成數(shù)目高于Hela癌細(xì)胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(圖1，表4)。

表2 miR-362表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 各組Hela癌細(xì)胞OD值、存活率水平的表達(dá)

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05，compared with miR-362 mimics group.

表4 各組Hela癌細(xì)胞克隆形成數(shù)目的表達(dá)

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05，compared with miR-362mimics group，.

2.5 各組Hela癌細(xì)胞凋亡率的表達(dá)

miR-362mimics組細(xì)胞凋亡率高于Hela癌細(xì)胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組細(xì)胞凋亡率低于Hela癌細(xì)胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(表5)。

2.6 各組Hela癌細(xì)胞G1期比較

miR-362mimics組G1期高于Hela癌細(xì)胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組G1期低于Hela癌細(xì)胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(圖2，表6)。

表5 各組Hela癌細(xì)胞凋亡率的表達(dá)

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05， comparedwith miR-362mimics group.

2.7 各組Hela癌細(xì)胞穿膜數(shù)的表達(dá)

miR-362 mimics組細(xì)胞穿膜數(shù)低于Hela癌細(xì)胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組穿膜數(shù)高于Hela癌細(xì)胞組、miR-362 mimics組(P<0.05)(表7，圖3)。

圖1 各組Hela癌細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較Figure 1 Comparison of the number of colony formation of Hela cancer cells in each group Note：A：Hela cells group；B：miR-362mimics group；C：miR-362inhibitor group.

圖2 各組Hela癌細(xì)胞G1期比較Figure 2 Comparison of G1 Phase of Hela Cancer Cells in Different GroupsNote：A：Hela cancer cells group，B：miR-362mimics group，C：miR-362inhibitor group.

表6 各組Hela癌細(xì)胞G1期比較

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group.cP<0.05，compared with miR-362mimics group.

表7 各組Hela癌細(xì)胞穿膜數(shù)的表達(dá)

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05，compared with miR-362mimics group.

圖3 各組Hela癌細(xì)胞G1期比較Figure 3 Comparison of G1 phase of Hela cancer cells in each group Note：A：Hela cancer cells group，B：miR-362mimics group，C：miR-362inhibitor group.

2.8 各組Hela癌細(xì)胞miR-362、SIX1 mRNA表達(dá)水平比較

miR-362mimics組miR-362 mRNA表達(dá)水平高于Hela癌細(xì)胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組miR-362 mRNA表達(dá)水平低于Hela癌細(xì)胞組、miR-362mimics組(P<0.05)。miR-362mimics組Six1 mRNA表達(dá)水平低于Hela癌細(xì)胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組Six1 mRNA表達(dá)水平高于Hela癌細(xì)胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(表8)。

表8 各組Hela癌細(xì)胞miR-362、SIX1 mRNA表達(dá)水平比較

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05，compared with miR-362mimics group.

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA在正常細(xì)胞特征和病理狀態(tài)中都發(fā)揮著重要作用。這些miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因而充當(dāng)腫瘤抑制因子或癌基因。因此，鑒定宮頸癌中癌癥特異性miRNA及其靶基因?qū)τ诶斫馑鼈冊(cè)谀[瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用是至關(guān)重要的，并且可以作為新的治療靶標(biāo)進(jìn)行研究。目前已經(jīng)在各種類(lèi)型的癌癥中研究了miR-362的表達(dá)。例如，在乳腺癌中，與對(duì)照CCD-1095Sk細(xì)胞系相比，發(fā)現(xiàn)miR-362在MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞系中顯著下調(diào)；慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系和慢性粒細(xì)胞白血病患者的新鮮血液樣本中miR-362的表達(dá)水平較低；在肝細(xì)胞癌中鑒定出明顯的miR-362下調(diào)，并且與腫瘤進(jìn)展顯著相關(guān)；在胃癌中，miR-362表達(dá)在腫瘤組織和細(xì)胞系中下調(diào)[11]。miR-362是CCL20的正向調(diào)節(jié)物，CCL20的過(guò)度表達(dá)抑制分化和結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移，因此miR-362與CCL2030 UTR的結(jié)合能抑制惡性腫瘤[12-13]。同時(shí)，許多miRNA在宮頸癌中被下調(diào)并且充當(dāng)腫瘤抑制劑。一項(xiàng)研究通過(guò)MTT法和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，發(fā)現(xiàn)miR-362的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路靶向磷酸肌醇3-激酶催化亞基δ(PIK3CD)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低致瘤性。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組miR-362mRNA表達(dá)水平低于癌旁組；淋巴血管間隙浸潤(rùn)、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度越深，miR-362mRNA表達(dá)率越低，miR-362表達(dá)與淋巴血管間隙浸潤(rùn)、病理學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度相關(guān)性明顯；Hela宮頸癌細(xì)胞體外試驗(yàn)表明，miR-362過(guò)表達(dá)可降低Hela宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲水平，增加Hela宮頸癌細(xì)胞凋亡水平。這與上述討論符合，同時(shí)提示miR-362在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了腫瘤抑制作用。

Six1作為轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物過(guò)程，包括癌癥。已在多種腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中檢測(cè)到Six1表達(dá)增加，表明Six1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)至關(guān)重要。Six1的表達(dá)升高與腫瘤惡性相關(guān)[14]。在乳腺癌、結(jié)直腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和胰腺癌中發(fā)現(xiàn)了Six1的異常升高。大量證據(jù)表明Six1有助于腫瘤發(fā)生。SIX1表達(dá)增加促進(jìn)血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。在胰腺癌細(xì)胞中，SIX1表達(dá)下調(diào)減少了MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)，從而抑制血管生成、侵襲和遷移[16]。此外，一系列研究報(bào)道了Six1在腫瘤發(fā)生中的功能可以通過(guò)miRNA調(diào)節(jié)。例如，下調(diào)的miR-370通過(guò)上調(diào)急性髓性白血病(AML)中的Six1而促進(jìn)增殖和細(xì)胞衰老[17]。研究已證實(shí)在宮頸癌中，Six1表達(dá)上調(diào)，Six1的表達(dá)水平與宮頸癌的臨床分期、分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。考慮到Six1在宮頸癌中的重要性和作用，它可以作為宮頸癌患者的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，miR-362mimics組Six1 mRNA表達(dá)水平低于Hela癌細(xì)胞組，miR-362inhibitor組Six1 mRNA表達(dá)水平高于Hela癌細(xì)胞組、miR-362mimics組。提示miR-362過(guò)表達(dá)可抑制Hela癌細(xì)胞Six1的表達(dá)，miR-362通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)Six1抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。miR-362可用作抑制人宮頸癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的治療靶標(biāo)。

綜上所述，miR-362在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了腫瘤抑制作用；其機(jī)制與miR-362通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)Six1抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有關(guān)。