林世杰，周 虎，張麗峰，冷 靜

（1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病之一，同時也是全球第二大死亡原因。其中，肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的原發(fā)性腫瘤，它是導致癌癥相關性死亡的第二大病因，也是全球第16大常見死因［1-2］。我國是肝細胞癌（下簡稱“肝癌”）的高發(fā)國家，肝癌是我國發(fā)病率第5位、死亡率第3位的惡性腫瘤［3-4］，目前肝癌的主要治療方法是手術切除，但由于多數(shù)患者被確診時已處于中晚期，所以肝癌患者的生存率普遍不高［5］，免疫治療是肝癌治療的熱門研究領域，近年來取得了一定的進展［6］。

外泌體（Exosomes）是一種由不同細胞分泌的囊泡小體，直徑一般為30～100 nm［7］，其含有大量與其來源及功能相關的蛋白質(zhì)、RNA等成分［8］。腫瘤細胞分泌的外泌體含有親代腫瘤細胞物質(zhì)，并通過將其內(nèi)容物轉運至受體細胞，從而影響細胞內(nèi)信號通路，在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用［9］。

樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）在啟動先天和適應性免疫反應中發(fā)揮重要作用。眾所周知，經(jīng)腫瘤誘導的DC是一把雙刃劍，一方面，不成熟的DC捕獲抗原并逐漸成熟，然后遷移到淋巴結激活T細胞，刺激宿主抗腫瘤免疫反應［10］；另一方面，腫瘤微環(huán)境中的特異性信號可能會抑制DC成熟，導致形成具有免疫抑制或免疫耐受的DC［11-12］。腫瘤來源外泌體（Tumor-derived exosomes，TEXs）在腫瘤免疫逃逸中有著重要作用，其自身攜帶的生物學信號可作用于腫瘤微環(huán)境、遠處組織及細胞，誘導免疫細胞功能紊亂［13］。研究表明TEXs可誘導DC免疫耐受或成熟障礙及活化特異性T細胞的功能缺陷［14-18］。基于上述研究，本課題組擬探索肝癌外泌體是否也可誘導DC的成熟障礙和功能減退。

1 實驗材料

1.1 細胞系 人肝癌細胞系HepG2由廣西醫(yī)科大學組織與胚胎學教研室提供，無癌活性的永生化肝細胞MIHA購自上海素爾生物科技有限公司，細胞用含有10%FBS（Gibco）的 RPMI-1640（Gibco）培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中；樹突狀細胞取自健康人外周血單個核細胞，培養(yǎng)于含10%FBSRPMI-1640培養(yǎng)基，于培養(yǎng)基中加入濃度為20 ng/ml的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、10 ng/ml的白介素4（Interleukin-4，IL-4）、105U/ml的 β 干擾素（Interferon-β，IFN-β）。

1.2 主要試劑 無外泌體FBS、ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE快速凝膠配制試劑盒購自碧云天公司；抗體Anti-CD63、Anti-Alix購自美國Santa cruz公司；抗體 FITC anti-Human CD83、FITC anti-Human CD80、APCanti-Human CD86、APCanti-HLA DR、Human Trustain FCX購自美國Biolegend公司；Human CD14 Positive selection kit、Ficoll淋巴細胞分離液購自美國Stemcell公司；Human IL-12 p70 ELISA Kit購自中國欣博盛公司；CCK-8試劑盒購自中國碧云天公司。

2 方法

2.1 外泌體的提取 收集含10%無外泌體FBS的HepG2細胞培養(yǎng)上清液，加入15 ml離心管中，300×g離心5 min去除細胞碎片，收集上清液于另一離心管，使用0.22μm無菌濾頭過濾上清液并收集進新管，于4℃10 000×g離心30 min。將收集的上清液加入10 kb超濾管中，水平離心機上3 000×g離心15 min，收集過濾后的上清液，加入提取試劑，將混合液放于4℃冰箱過夜，次日將混合液置于離心機上，1 500×g、4℃離心30 min，棄去上清液，用PBS緩沖液重懸沉淀，BCA蛋白濃度測定后將樣本置于-80℃冰箱保存。通過透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，用PBS稀釋外泌體樣本，于銅網(wǎng)上滴加10μl樣本，室溫放置1～2 min，濾紙吸去多余液體。向銅網(wǎng)上滴加30μl 2%磷鎢酸，室溫負染1～2 min，并用濾紙吸干多余的負染液。室溫下用PBS沖洗網(wǎng)格3遍，白熾燈下晾干后電鏡下觀察。

2.2 Nano FCM檢測外泌體粒徑分布及顆粒濃度 Nano FCM是類似于流式細胞儀工作原理的微小顆粒分析儀器，檢測范圍在20～200 nm之間。本研究使用Nano FCM儀器檢測ExoQuick-TC試劑盒法提取的HepG2細胞外泌體，步驟如下：樣本獲得的外泌體樣本用200μl PBS重懸后，取10μl用PBS稀釋500倍，先用單純PBS上樣，檢測溶液粒徑值，作為外泌體上機檢測背景值，將稀釋好的外泌體樣本上機，檢測其粒徑分布及顆粒濃度。

2.3 Western Blot檢測外泌體及細胞的標記蛋白 提取細胞總蛋白，方法為：用預冷的PBS清洗細胞3次，在細胞中加入200μl RIPA蛋白裂解液（含2μl PMSF），冰上裂解10 min，12 000×g、4 ℃離心15 min，收集上清液，BCA法測定樣本蛋白濃度后待用。取50 ml外泌體樣本，加入50μl RIPA蛋白裂解液。取20μg蛋白樣本加入上樣緩沖液中，于99℃金屬浴中煮10 min，經(jīng)SDS-PAGE分離電泳，半干轉PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后，分別加入一抗（按1∶1 000稀釋）：Anti-CD63、Anti-Alix、Cytochrome C，4 ℃孵育過夜。按1∶2 500稀釋二抗，室溫孵育2 h，顯影收集數(shù)據(jù)。

2.4 DC的誘導 取健康志愿者的外周血10 ml經(jīng)過Ficoll密度離心后分離出人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），經(jīng)磁珠分離后獲得CD14+細胞。將分離的細胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為5×105個/ml，接種于 48 孔板，500 μl/孔；于培養(yǎng)基中加入 GM-CSF 20 ng/ml、IL-4 10 ng/ml、IFN-β 105U/ml，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向不成熟的DC中加入50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的 HepG2外泌體，同時加入10 ng/ml的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激 DC成熟，培養(yǎng)72 h后收獲DC待檢，將上清液凍存于-80℃。

2.5 DC表面分子染色及流式細胞儀檢測 將DC收集于1.5 ml EP管中，使用1 ml 0.1%FBSRPMI-1640清洗1次，用200μl完全培養(yǎng)基重懸細胞。各管平分為2組，并從各管中分別取出10μl細胞懸液放于1個新管中作為不染色的空白對照，各管加入3.5μl FC封閉抗體，冰上孵育15 min。分2組加入熒光標記抗體，冰上孵育 30 min：① anti-CD83 FITC、anti-CD86 APC；② anti-CD80 FITC、anti-HLA DR APC。各管加入1 ml 1%FBSRPMI-1640洗細胞1次，離心棄上清液后加入500μl 4%多聚甲醛固定細胞，流式上機檢測。

2.6 ELISA檢測DC培養(yǎng)上清液中IL-12的水平 從-80℃冰箱中取出DC培養(yǎng)上清液，解凍。按照Human IL-12 p70 ELISA試劑盒說明書進行實驗。

2.7 CCK-8檢測DC刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力 提取與DC來源不同的健康個體的PBMCs，用2%FBSRPMI-1640重懸后接種于細胞培養(yǎng)皿，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，取未貼壁的細胞即為淋巴細胞。完全培養(yǎng)基重懸細胞后加入96孔板，每孔100μl，2×105個/孔；取已刺激成熟的DC加入96孔板，每孔100 μl，2×104個/孔；即 DC∶淋巴細胞=1∶10；培養(yǎng)72 h后，各孔加入20μl CCK-8溶液，放置于培養(yǎng)箱3～4 h后，酶標儀檢測A450OD值。按公式計算：刺激指數(shù)（Stimulating Indext，SI）=（實驗組OD值-未刺激組OD值）/未刺激組OD值。SI值越大則DC刺激異體T細胞增殖的能力越強。

2.8 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0進行數(shù)據(jù)處理和作圖，統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組實驗組間計量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析；兩組數(shù)據(jù)之間的差異比較用t檢驗，P＜0.05認為差異有顯著性意義。

3 結 果

3.1 HepG2細胞來源外泌體電鏡鑒定 見圖1。

圖1 外泌體的電鏡觀察圖

如圖1所示，在透射電鏡下觀察，本研究所提取的外泌體大小在30～100 nm以內(nèi)，其呈現(xiàn)出外泌體獨特的杯狀形態(tài)，有著雙膜結構，可根據(jù)其形態(tài)特征證明其為外泌體［19］。

3.2 外泌體粒徑分布及濃度 采用Nano FCM儀器檢測ExoQuick-TC試劑盒法提取的HepG2細胞外泌體樣本，顯示其平均粒徑為75.81±26.47 nm（圖2），濃度為 4.98×1010個/ml（10 ml培養(yǎng)上清液所得外泌體用200μl PBS稀釋）。同時，提取MIHA細胞外泌體，Nano FCM檢測顯示其粒徑分布在50～150 nm之間，平均粒徑74.91±25.38 nm（圖3）。

3.3 Western Blot檢測外泌體特征性蛋白的表達 見圖4、圖5。

圖4、圖5顯示，HepG2和MIHA細胞及其來源的細胞外泌體表達CD63與Alix，并且外泌體中無細胞色素C（Cytochrome C），表明了本研究所提取的外泌體并無細胞碎片的污染［20］，可為后續(xù)的實驗排除了細胞裂解物的干擾。

圖2 HepG2外泌體的Nano FCM檢測結果

圖3 MIHA外泌體的Nano FCM檢測結果

圖4 HepG2細胞及外泌體相關蛋白表達

圖5 MIHA細胞及外泌體相關蛋白表達

3.4 HepG2細胞來源外泌體對DC成熟的影響 流式檢測DC各表面分子表達結果見圖5。流式檢測發(fā)現(xiàn)，與僅加入LPS的對照組相比，HepG2外泌體刺激的DC表達CD80和CD83的細胞比例明顯下降，差異有顯著性意義（P＜0.01），并呈一定的濃度依賴性，即外泌體含量越高陽性率越低；MIHA-EXO組較單獨LPS組無明顯差異，結果見表1。而HepG2外泌體刺激的DC表達CD86、HLA-DR的比例與LPS對照組比較無明顯差異，陽性率均在95%以上（圖5）。

表1 HepG2細胞來源外泌體對DC中CD80、CD83表達的影響 （±s）

表1 HepG2細胞來源外泌體對DC中CD80、CD83表達的影響 （±s）

注：與LPS組比較，①P＜0.01

組 別LPS 50μg/ml HepG2 EXO 100μg/ml HepG2 EXO 200μg/ml HepG2 EXO 200μg/ml MIHA EXO n 3 3 3 3 3 CD80陽性表達率（%）6.80±0.16 4.27±0.14①3.24±0.16①2.76±0.10①5.47±0.38 CD83陽性表達率（%）74.78±1.13 71.49±1.30①68.91±1.31①66.09±2.05①72.85±0.50

3.5 HepG2外泌體對DC分泌IL-12的影響 見表2。結果顯示，與LPS對照組相比，濃度為200μg/ml的HepG2 EXO干預組DC培養(yǎng)上清液中IL-12的量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），50 μg/ml、100 μg/ml HepG2 EXO干預組則無明顯差異（P＞0.05），提示肝癌細胞外泌體濃度較高時對DC分泌IL-12有抑制作用。200μg/ml的MIHA EXO組較單獨LPS組無顯著差異（P＞0.05）。

3.6 HepG2外泌體對DC刺激淋巴細胞增殖效應的影響 見表3。

結果表明，與LPS對照組比較，200μg/ml HepG2 EXO對DC刺激淋巴細胞增殖效應的刺激指數(shù)明顯降低（P＜0.05），而50μg/ml、100μg/ml HepG2 EXO干預后差異不明顯（P＞0.05），這說明較高濃度的肝癌細胞外泌體可以抑制DC刺激異體T細胞增殖的能力。200μg/ml MIHA EXO組較單獨LPS組無顯著差異（P＞0.05）。

4 討論

圖5 流式檢測DC表面分子表達結果

表2 ELISA檢測DC培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-12的濃度 （±s）

表2 ELISA檢測DC培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-12的濃度 （±s）

注：與LPS組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別Immature LPS 200μg/ml MIHA EXO 50μg/ml HepG2 EXO 100μg/ml HepG2 EXO 200μg/ml HepG2 EXO n 3 3 3 3 3 3濃度（pg/ml）21.23±3.37②183.46±36.82 173.55±47.03 168.07±55.64 176.11±56.81 93.98±9.25①

表3 HepG2外泌體對DC刺激淋巴細胞增殖效應的刺激指數(shù) （±s）

表3 HepG2外泌體對DC刺激淋巴細胞增殖效應的刺激指數(shù) （±s）

注：與LPS組比較，①P＜0.05

組 別Immature LPS 200μg/ml MIHA EXO 50μg/ml HepG2 EXO 100μg/ml HepG2 EXO 200μg/ml HepG2 EXO n 3 3 3 3 3 3刺激指數(shù)（%）30.02±11.03①70.09±10.98 67.93±6.47 58.17±5.81 56.51±13.02 38.96±10.12①

DC是人體內(nèi)最重要的抗原提呈細胞，對天然免疫與特異性免疫有著重要的連接作用，DC可以活化初始T淋巴細胞，在人體抗腫瘤特異性免疫應答的啟動中發(fā)揮著重要作用［21］。不成熟的DC通過表達模式識別受體，可識別并攝取外源性抗原，還有很強的抗原加工能力，但是由于其低表達MHCⅡ類分子、黏附分子以及CD80、CD83、CD86等共刺激分子，所以不成熟的DC激活免疫應答的能力較弱［22-23］。當不成熟的DC接觸到LPS等炎性刺激劑后可以逐漸發(fā)育成熟。成熟的DC識別、攝取和加工抗原的能力減弱，但是高表達MHCⅡ類分子、黏附分子和共刺激分子，因此能有效地提呈抗原、誘導T細胞活化，啟動特異性免疫應答。在腫瘤微環(huán)境中DC常常是不成熟的，因此無法誘導有效的特異性抗腫瘤免疫應答，原因主要有兩個方面：一方面是因為腫瘤細胞存在抗原的缺失和抗原調(diào)變，使不成熟DC難以識別和攝取腫瘤抗原；另一方面，腫瘤微環(huán)境中的特異性抑制信號可以抑制DC的成熟，并且使得其變成具有免疫抑制作用的DC。TEXs作為腫瘤細胞物質(zhì)運輸與信息傳遞的載體，在腫瘤免疫抑制中發(fā)揮重要作用，其不僅能促進局部腫瘤微環(huán)境的形成，還因其具有脂質(zhì)雙層膜的結構，可以穩(wěn)定地遠距離運輸，作用于全身，這一功能與腫瘤的轉移密切相關。研究表明多種惡性腫瘤的TEXs可以誘導DC的成熟抑制、免疫耐受、抗原提呈功能下降或喪失等［17，24-25］，但是肝癌來源的 TEXs對 DC 功能抑制的研究還較少。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞HepG2來源的外泌體對DC表面CD80、CD83的表達有一定抑制作用。CD80是DC提供T細胞活化“第二信號”的重要分子，如果缺乏CD80等共刺激分子提供的“第二信號”，則接受了“第一信號”的T細胞不但不能被激活產(chǎn)生特異性免疫應答，反而會發(fā)生失能［26-27］。CD83是DC的成熟標記之一，腫瘤組織中的樹突狀細胞CD83分子表達量的高低是評判腫瘤預后的指標之一，CD83表達越低則預后越差［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌外泌體降低了DC這兩種分子的表達，提示肝癌細胞通過外泌體途徑誘導全身性的免疫抑制是一種促進腫瘤發(fā)展與轉移的可能機制。IL-12又稱細胞毒性淋巴細胞成熟因子（cytotoxic lymphoctyto maturation factor，CLMF）或自然殺傷細胞刺激因子（natural killer cell stimulation factor，NKSF），其是在 Th1 細胞分化和Th1型細胞因子介導的抗腫瘤免疫和抗炎癥免疫中發(fā)揮作用的最重要細胞因子，主要由活化的巨噬細胞、DC和中性粒細胞產(chǎn)生，可通過促進IFN-γ的產(chǎn)生誘導CD4+Th0細胞向Th1細胞分化，在Th1反應中處于不可或缺的地位［30-32］。IL-12作為一種細胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子有直接抗腫瘤作用，在原發(fā)性、繼發(fā)性腫瘤的抗腫瘤免疫反應中均發(fā)揮重要作用［33-34］，我們發(fā)現(xiàn)，肝癌外泌體有較強的抑制DC分泌IL-12的免疫抑制效應，說明肝癌外泌體可以導致DC的抗腫瘤免疫功能降低。在混合淋巴細胞反應中，我們利用CCK-8試劑檢測各孔淋巴細胞的相對增殖數(shù)量，CCK-8試劑中含有WST-8，在電子載體PMS的作用下可以與細胞中線粒體內(nèi)的某些脫氫酶發(fā)生反應，生成甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye），該物質(zhì)具有高度水溶性，呈橙黃色。當活細胞數(shù)量越多時，甲瓚的生成也越多，顏色就越深，根據(jù)這一特性可以用酶標儀測量450 nm處的吸光度來判斷各孔中活細胞相對數(shù)量，并且CCK-8試劑對細胞毒性也非常小，一般不會對細胞生長狀態(tài)造成影響［35］?；旌狭馨图毎磻梢灾苯臃从矰C誘導同種異體T淋巴細胞增殖的能力，成熟的DC誘導異體T淋巴細胞增殖的能力較強，本研究觀察到較低劑量（50μg/ml、100μg/ml）的肝癌細胞外泌體沒有明顯影響DC刺激異體T淋巴細胞的能力，而高劑量（200μg/ml）肝癌細胞外泌體可以使DC刺激指數(shù)降低，進一步驗證了肝癌細胞外泌體對DC的免疫功能抑制。

綜上，肝癌細胞外泌體對DC表面成熟相關分子表達、介導抗腫瘤免疫的細胞因子IL-12的分泌、刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力均有一定的抑制作用，這為我們理解肝癌的免疫逃逸及發(fā)展、轉移提供了思路，同時也為肝癌的免疫治療，特別是DC相關的免疫治療提供了理論基礎。