復方雷公藤微乳凝膠釋放度與體外透皮特性的研究

王曉娟，李 娟，李 周

（1.洛陽市第二中醫(yī)院，河南 洛陽 471003；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006）

復方雷公藤處方由雷公藤、川芎、炙乳香和炙沒藥等中藥組成，是用于治療類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的臨床經驗處方，其中雷公藤為方中主藥。雷公藤已經廣泛用于RA等免疫系統(tǒng)疾病的治療，療效確切，幾乎沒有可以替代的中藥［1-2］，但是雷公藤具有較大的毒性，且有效劑量和中毒劑量接近，口服雷公藤制劑容易因為劑量問題而造成毒副反應［3］，為了減少雷公藤口服給藥所造成的毒性反應，本課題組擬將復方雷公藤開發(fā)成經皮給藥制劑——微乳凝膠。微乳凝膠（microemulsion based gels，MBGs）是近十幾年來興起的一種新劑型，它是由油相、表面活性劑和助表面活性劑組成的透明、均一的熱力學穩(wěn)定體系［4］。微乳能增加藥物的溶解度和經皮滲透性，延長藥物作用時間［5］，但是微乳的流動性強，黏附性差。因此，為了適合經皮給藥，通常將微乳進一步制成微乳凝膠。本研究以雷公藤中主要有效成分之一的雷公藤甲素為指標，對復方雷公藤微乳凝膠體外釋放度進行了考察，同時比較了復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠以及復方雷公藤巴布劑的體外透皮特性，為將復方雷公藤處方開發(fā)成微乳凝膠提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 儀器 TK-12A型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；Waters高效液相色譜儀（美國Waters公司，515泵，2487紫外檢測器）；N3000色譜工作站（浙江大學）；AUW120D十萬分之一分析天平（日本島津）；DLB200電子天平（日本島津）。

1.2 試藥與試劑 復方雷公藤提取物（雷公藤甲素的含量為0.128%，實驗室自制）；透析袋（MWCO：8 000～14 000，上海金穗生物科技有限公司）；油酸（廣州化學試劑廠）；OP乳化劑（天津市福晨化學試劑廠）；卡波姆940（CP-940，廣州化學試劑廠）；三乙醇胺（廣州化學試劑廠）；無水乙醇（天津市百世化工有限公司）；壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯（廣州化學試劑廠）；乳酸（魚臺海納環(huán)?？萍加邢薰荆?；殼聚糖（濟寧佰一化工有限公司）；卡拉膠（深圳安泰生物科技有限公司）；雷公藤甲素標準品（成都普菲德生物技術有限公司，批號：140424）；甲醇（色譜純，迪馬公司）；水為蒸餾水；其它試劑均為分析純。

1.3 動物 健康雌性昆明種小鼠，體質量20±2 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0020。

2 方法與結果

2.1 復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠、復方雷公藤巴布劑的制備

2.1.1 復方雷公藤微乳凝膠的制備 經前期預試驗確定復方雷公藤微乳凝膠的制備方法：在室溫下取復方雷公藤提取物1.5 g加入到1.58 g油酸中超聲溶解，然后加入壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯7.58 g、OP乳化劑1.89 g、無水乙醇4.73 g，超聲攪拌均勻，在磁力攪拌器作用下逐滴加入80.72 g水，攪拌0.5 h，即得復方雷公藤微乳；將2 g卡波姆940加入到制備好的復方雷公藤微乳中，溶脹24 h，用三乙醇胺調節(jié)pH6～7，攪拌均勻，即得復方雷公藤微乳凝膠，載藥量為1.5%。

2.1.2 復方雷公藤凝膠的制備 取2 g卡波姆940用適量蒸餾水進行溶脹，再取1.5 g復方雷公藤提取物用10 ml乙醇進行溶解，加入5 g甘油，混合均勻后一并加入到卡波姆940溶液中，攪拌均勻后，加入三乙醇胺調節(jié)pH6～7，加水至100 g，制備得載藥量為1.5%的復方雷公藤凝膠。

2.1.3 復方雷公藤巴布劑的制備 參考專利“雷公藤巴布劑的制備方法（公開號：CN102008536A）”［6］制備復方雷公藤巴布劑，具體制備方法如下：將0.15 g乳酸加水15 ml混勻，然后加入0.75 g殼聚糖，加熱至40～65℃攪拌使完全溶解，并混合均勻，作為A相；將18 g聚乙烯醇加水24 ml，加熱至55～80℃溶解，攪拌均勻，作為B相；將1.5 g明膠加水12 ml，加熱至40～60℃攪拌使完全溶解，并混合均勻，作為C相；將12 g聚乙烯毗咯烷酮和3 g卡拉膠加水33 ml，加熱至40～60℃攪拌使完全溶解，并混合均勻，作為D相。將A、B兩相混合，在40～65℃下攪拌依次加入C相和D相，然后加入12 g甘油，在40～60℃溫度下混勻即得巴布劑基質。取1.5 g復方雷公藤提取物加入到上述方法制備好的基質中，攪拌數分鐘，涂布，即得復方雷公藤巴布劑，巴布劑最終大載藥量為1.2%。

2.2 雷公藤甲素的含量測定

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取雷公藤甲素2.23 mg置于10 ml的量瓶中，用甲醇定容至刻度，振搖即得濃度為223μg/ml的雷公藤甲素對照品貯備液。

2.2.2 陰性樣品溶液的制備 將無水乙醇與生理鹽水按4∶6的比例混合均勻，即得陰性樣品（空白接收液）。

2.2.3 供試品溶液的制備 體外釋放度試驗供試品溶液的制備：取雷公藤微乳凝膠擴散池接收液，過0.22μm微孔濾膜，即得。體外透皮試驗供試品溶液的制備：取復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠及復方雷公藤巴布劑體外透皮接收液，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 色譜條件色譜柱為Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（45∶55），流速為1.0 ml/min，檢測波長為218 nm，進樣量為10 μl，柱溫為25℃。理論塔板數按雷公藤甲素峰計算應不低于4 000，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2.5 標準曲線的制備 將雷公藤甲素對照品貯備液進行倍比稀釋，得到雷公藤甲素濃度為0.112μg/ml、0.223 μg/ml、0.446 μg/ml、1.115 μg/ml、2.23 μg/ml、4.46 μg/ml、8.92 μg/ml的對照品系列溶液，按照2.2.4項下色譜條件依次進樣，進樣量為10μl，以峰面積（Y）對對照品濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=13 978X+9 560.5，r=0.999 9，說明雷公藤甲素在0.112～19.84μg/ml范圍內呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗 取8.92μg/ml的對照品溶液10μl，連續(xù)重復進樣6次，測得雷公藤甲素峰面積并計算其RSD值。結果RSD為1.12%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 將2.2.3項下所制備的供試品溶液置于冷藏（0～4℃）、避光條件下儲存，取同一供試品溶液，按照2.2.4項下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 進樣，進樣量為10 μl，測定峰面積并計算其RSD值。結果RSD為1.37%（n=7），表明雷公藤甲素在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3 體外釋放度試驗［7-8］采用改良Franz擴散池進行實驗，擴散池容積為8 ml，有效擴散面積為3.14 cm2。將已處理過的半透膜置于供給池和接收池之間，供給池中均勻涂抹復方雷公藤微乳凝膠1 g，供給池上端用封口膜封口以免雜質掉落，接收室中加入已超聲脫氣的乙醇-生理鹽水（4∶6），將供給池與接收池用鐵夾固定，縫隙用石蠟密封，防止同批擴散池水浴中的水進到供給池中。調節(jié)溫度至32±0.5℃，恒速攪拌（約200 r/min），分別于實驗開始后的1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h從樣品接收室吸取1 ml接收液，同時向接收室中補加同溫度同體積的空白接收液。將所吸取的接收液用0.22μm微孔濾膜過濾后，按2.2.4項下色譜條件進樣分析，并按下式計算累計滲透量（Qn）、滲透速率常數（J），并計算累計釋放率（R）。

式中，Qn：第n個時間點的累計面積透過量（μg/cm2）；V：接收室中接收液的總體積（8 ml）；Vi：每次的取樣體積（1 ml）；Cn：第n個取樣點測得的藥物質量濃度（μg/ml）；A：有效擴散面積（3.14 cm2）；J：釋放速率常數/透皮速率常數［μg/（cm2·h）］，M為1 g復方雷公藤微乳凝膠中的雷公藤甲素的量，即19.22μg。

求得累積滲透量之后，將累積滲透量Q對時間t進行方程擬合，并求得回歸系數r，回歸系數最大的方程即為最佳擬合方程，分別有下列三種方式：零級方程 Q=at+b；一級方程 lnQ=at+b；Higuchi方程Q=at1/2+b，結果見表1。

表1 雷公藤甲素釋放度方程的擬合 （n=3）

從表1可以看出，根據回歸系數r可知，雷公藤甲素在復方雷公藤微乳凝膠中釋藥特性符合零級釋藥方程Q=1.25t+2.67，即藥物沒有突釋也沒有迅速釋放（一級方程），而是基本上以恒定的速率釋藥，釋藥速率為1.25μg/（cm2·h）；雷公藤微乳凝膠在12 h內的累積釋藥量達到91%，釋藥較完全。復方雷公藤微乳凝膠符合經皮給藥制劑釋放度的要求。

2.4 體外透皮實驗［9］

2.4.1 離體鼠皮的制備與保存 取健康小鼠，用電動

剃毛機剃去小鼠腹部毛，再用6%的硫化鈉溶液對剩余的毛發(fā)進行脫除，兩天后小鼠脫臼處死，小心剝離腹部皮膚，剔除皮下脂肪組織及粘連物，用生理鹽水反復沖洗干凈，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ㄒ粋€星期內使用完）。實驗前自然解凍，每次實驗前檢查皮膚的完整性，不能有任何破損。

2.4.2 透皮實驗方法 參照2.3項下體外釋放度試驗方法進行，將供給池和接收池之間的屏障由半透膜換成離體小鼠腹部皮膚，角質層朝上（供給池），分別將復方雷公藤微乳凝膠1 g、復方雷公藤凝膠1 g和復方雷公藤巴布劑0.8 g均勻涂抹于小鼠皮膚之上，開始進行體外透皮試驗，測得不同制劑不同時間（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h）接收池中雷公藤甲素藥物濃度，并計算累積透皮量，同時對時間進行回歸，求得Q-t方程，以透皮速率為指標比較復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠和復方雷公藤巴布劑三者的透皮性能，結果如表2、圖2。

表2 不同制劑中雷公藤甲素經皮滲透實驗結果 （±s，n=3）

表2 不同制劑中雷公藤甲素經皮滲透實驗結果 （±s，n=3）

制劑復方雷公藤微乳凝膠復方雷公藤凝膠復方雷公藤巴布劑經皮滲透回歸曲線Q=0.419t+0.917 Q=0.205t+0.093 Q=0.253t+0.040 Q24 h（μg/cm2）11.24±1.03 4.94±0.26 6.12±0.42 J［μg/（cm2·h）］0.419 0.205 0.253

圖2 不同制劑中雷公藤甲素經皮滲透Q n對t曲線

從表2和圖2可知，復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤巴布劑、復方雷公藤凝膠24 h的體外累積透皮量與時間的曲線方程分別為Q=0.419t+0.917、Q=0.253t+0.040、Q=0.205t+0.093，其中復方雷公藤微乳凝膠的透皮速率為0.419μg/（cm2·h），均大于復方雷公藤巴布劑［0.253μg/（cm2·h）］和復方雷公藤凝膠［0.205μg/（cm2·h）］，表明復方雷公藤微乳凝膠體外透皮特性優(yōu)于復方雷公藤凝膠劑和復方雷公藤巴布劑，適合開發(fā)成經皮給藥制劑。

3 討 論

本試驗研究中，透皮擴散池的接收液為40%乙醇溶液（乙醇∶水為4∶6），是因為在預實驗中發(fā)現雷公藤甲素在40%乙醇溶液中溶解度較好，在進行透皮擴散試驗時符合漏槽條件，因此選擇其作為透皮擴散試驗的接收液；在2.4.2項體外透皮試驗中，復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠與復方雷公藤巴布劑給藥量有所不同，這是因為復方雷公藤巴布劑的載藥量與前兩者不同，為了保證給藥量中雷公藤甲素的含量一致，因此調整了復方雷公藤巴布劑的給藥量。采用硫化鈉對小鼠皮膚進行脫毛時，由于硫化鈉具有較強的堿性，會對皮膚角質層造成一定程度上的破壞，從而改變皮膚對藥物的透過性，因此，本實驗在用硫化鈉對小鼠腹部皮膚脫毛后，要過兩天再取小鼠皮膚，目的是讓小鼠皮膚自然恢復。

研究表明，復方雷公藤微乳凝膠體外釋放速率為1.25μg/（cm2·h），遠大于其透皮速率0.419μg/（cm2·h），因此復方雷公藤微乳凝膠的釋放不是其透皮速率的限速環(huán)節(jié)，其釋放行為符合零級方程，即可以達到平穩(wěn)緩慢釋藥，一方面不會由于快速釋藥而導致透皮吸收過快、體內藥物濃度過高而造成毒性反應，另一方面可以維持較久的給藥時間，無需頻繁給藥，因此滿足經皮給藥制劑的要求。復方雷公藤微乳凝膠透皮特性優(yōu)于復方雷公藤凝膠和復方雷公藤巴布劑，說明了微乳可以促進藥物的經皮吸收，加之巴布劑的成型工藝復雜，因此復方雷公藤處方更適合開發(fā)成微乳凝膠。