王子卿 李燕 王芬 江洋 張弘 屈直 李志明 杜倩倩 黃璐璐

摘要：目的? 觀察二陳湯加沙參、麥冬對Lewis肺癌小鼠免疫功能及腫瘤血管生成的影響，探討其抗腫瘤的可能作用機制。方法? 30只C57BL/6小鼠腋窩皮下注射Lewis肺癌細(xì)胞造模。隨機分為模型組、中藥組和順鉑組，每組10只。模型組予0.4 mL/20 g生理鹽水灌胃，中藥組予0.4 mL/20 g二陳湯加沙參、麥冬藥液灌胃，順鉑組予3 mg/kg順鉑溶液200 μL/20 g腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d，并予0.4 mL/20 g生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。稱定小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、胸腺質(zhì)量和脾質(zhì)量，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù);流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟淋巴細(xì)胞亞群水平;Western blot檢測腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR）-1、VEGFR-2、p-p38、p-JNK的表達。結(jié)果? 與模型組比較，各給藥組小鼠瘤質(zhì)量顯著降低（P<0.01），組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），中藥組和順鉑組抑瘤率分別為33.64%、46.53%，中藥組胸腺指數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、B細(xì)胞水平均顯著升高，VEGFR-2、p-JNK表達明顯降低，順鉑組CD8+明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與順鉑組比較，中藥組胸腺指數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+均顯著升高，VEGFR-2、p-p38、p-JNK表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論? 二陳湯加沙參、麥冬可提高Lewis肺癌小鼠免疫功能，同時抑制腫瘤血管生成，其抗腫瘤作用機制可能與抑制VEGFR-2表達、降低p-JNK活性相關(guān)。

關(guān)鍵詞：二陳湯;沙參;麥冬;Lewis肺癌小鼠;免疫功能;腫瘤血管生成;JNK通路;p38通路

中圖分類號：R285.5??? 文獻標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）08-0040-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.009????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To investigate the effect of Erchen Decoction combined with Adenophora Stricta and Ophiopogonis Radix on immune function and tumor angiogenesis in Lewis lung cancer mice and to explore the possible mechanism of its anti-tumor action. Methods Totally thirty C57BL/6 mice were used to establish Lewis lung cancer model. They were randomly divided into model group， TCM group， and cisplatin group， with 10 mice in each group. The model group was given 0.4 mL/20 g normal saline by gastric lavage; TCM group was given 0.4 mL/20 g TCM solution by gastric lavage; the cisplatin group was given 3mg/kg cisplatin solution 200 μL/20 g byintraperitoneal injection once a day for 3 days， and 0.4 mL/20 g normal saline by gastric lavage once a day for 14 consecutive days. The weight of mice， tumor， thymus and spleen were measured， and the tumor inhibition rate， thymus index and spleen index were calculated. The level of lymphocyte subsets in spleen of mice was measured by flow cytometry. The protein expressions of VEGFR-1， VEGFR-2， p-p38 and p-JNK in tumor tissue were detected by Western blot method. Results Compared with the model group， the tumor weight of TCM group and cisplatin group decreased significantly （P<0.01）， and there was no statistical significance between the two groups （P>0.05）. The anti-tumor rates of TCM group and cisplatin group were 33.64% and 46.53%， respectively. The thymus index， CD3+ cells， CD4+ cells， CD8+ cells， CD4+/CD8+， and B cells in TCM group increased significantly （P<0.05， P<0.01）， the expression of VEGFR-2 and p-JNK protein decreased significantly， and the level of CD8+ cells in the cisplatin group increased （P<0.05）. Compared with the cisplatin group， the thymus index， CD3+ cells， CD4+ cells and CD8+ cells in TCM group increased significantly， and the expressions of VEGFR-2， p-p38 and p-JNK decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Erchen Decoction combined with Adenophora Stricta and Ophiopogonis Radix can improve the immune function of Lewis lung cancer mice and inhibit tumor angiogenesis. Its possible anti-tumor mechanism is to inhibit the expression of VEGFR-2 and reduce the activity of p-JNK.

Keywords： Erchen Decoction; Adenophora Stricta; Ophiopogonis Radix; Lewis lung cancer mice; immune function; tumor angiogenesis; JNK pathway; p38 pathway

肺癌是目前發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，中國每年新發(fā)病例約78.1萬[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌發(fā)病的80%～85%，約57%的NSCLC患者最初診斷時已為進展期肺癌，已失去手術(shù)治愈的機會，盡管當(dāng)今治療手段多樣，但進展期肺癌總生存期目前仍然較短[2]。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，是化痰的經(jīng)典方劑，可顯著提高NSCLC痰證患者的生活質(zhì)量及T淋巴細(xì)胞亞群水平[3-4]。前期研究顯示，二陳湯可降低肺癌A549細(xì)胞膜表面細(xì)胞黏附分子-1（intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1）表達及p38活性，表明二陳湯可能是通過抑制p38通路而實現(xiàn)對ICAM-1表達的調(diào)控，從而抑制NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5-6]。北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院王沛教授根據(jù)“肺為嬌臟，喜潤惡燥”的特點，主張針對肺癌應(yīng)注重養(yǎng)陰潤肺生津，其治療肺癌80%以上處方加沙參、麥冬[7]。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，以二陳湯加沙參、麥冬干預(yù)Lewis肺癌小鼠，觀察其對Lewis肺癌小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響，探討其抗腫瘤的可能作用機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物及瘤株

SPF級C57BL/6小鼠30只，雄性，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所SPF級動物實驗室，溫度（23±2）℃，相對濕度（55±10）%，光照12 h，噪音<60 dB，自由攝食飲水。Lewis肺癌瘤株，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。

1.2? 藥物

按照《太平惠民和劑局方》二陳湯的配伍比例及臨床用藥量確定組方（法半夏15 g，陳皮15 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，生姜7 g，烏梅8 g，沙參20 g，麥冬15 g），飲片均為免煎顆粒，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房配制，并根據(jù)人與動物給藥劑量公式換算小鼠所需劑量[8]，將各組顆粒劑按所需溶媒量溶解于去離子水中，制備溶液;注射用順鉑，10 mg/瓶，齊魯制藥（海南）有限公司，批號AA1A7030B。

1.3? 主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)液和小牛血清，美國 Gibco公司;RIPA組織/細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Tween-20，北京索萊寶科技有限公司;十二烷基磺酸鈉（SDS）、過硫酸銨、聚丙烯酰胺、焦碳酸二乙酯、甘氨酸，美國Sigma公司;ECL超敏顯色劑，北京普利萊公司;抗體，美國BD公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗鼠二抗，中杉金橋生物技術(shù)有限公司。潔凈工作臺（HDLApparatus），CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司），5810R離心機（德國Eppendorf公司），光譜掃描多功能酶標(biāo)儀（美國Pro-mega公司），電泳儀（美國BIO RAD公司）。

1.4? 分組、造模及給藥

取C57BL/6小鼠30只，另取對數(shù)生長期Lewis肺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，接種于C57BL/6小鼠右側(cè)腋窩皮下，0.2 mL/只[9]。接種后第2日，將30只小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、中藥組和順鉑組，每組10只。于接種造模后第2日開始給藥，模型組給予0.4 mL/20 g生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)14 d;中藥組給予0.4 mL/20 g藥液灌胃，每日1次，連續(xù)14 d;順鉑組給予3 mg/kg順鉑溶液200 μL/20 g腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d，同時給予0.4 mL/20 g生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。接種后第5日，在小鼠右側(cè)腋窩皮下可觸及黃豆大小腫塊，標(biāo)志造模成功。

2? 實驗方法

2.1? 一般觀察

觀察小鼠毛發(fā)、聚集、反應(yīng)、進食量及死亡等情況，評價小鼠生存質(zhì)量。

2.2? 抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定

第14日灌胃結(jié)束2 h后，脫頸處死小鼠。稱定小鼠質(zhì)量，完整剝離小鼠胸腺及腫瘤組織并稱重，無菌條件剝離小鼠脾臟并稱重。分別計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）÷模型組平均瘤質(zhì)量×100%，胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g），脾指數(shù)（mg/g）=脾質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g）。

2.3? 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群

小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液制備：無菌取脾，用無菌注射器針頭將脾臟劃碎，轉(zhuǎn)移至70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)中，浸泡在含5%FBS RPMI1640中，用注射器塞輕輕研磨，直至組織全部通過篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞至離心管中，300×g離心5 min，棄上清液，沿離心管壁緩慢加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解5～10 min，300×g離心5 min，棄上清液，加含5%FBS RPMI1640重懸沉淀脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)基洗滌，300×g離心5 min，重復(fù)2次，最后用含5%FBS RPMI1640培養(yǎng)液重懸脾淋巴細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)至1×107/mL備用。吸取上述脾細(xì)胞懸液100 μL至流式管底，向流式管中加入FITC標(biāo)記抗小鼠CD3單抗、PE標(biāo)記抗小鼠CD8a單抗、PerCP-Cy5.5標(biāo)記抗小鼠CD45單抗、APC標(biāo)記抗小鼠CD4單抗、FITC標(biāo)記抗小鼠CD19單抗、APC標(biāo)記抗小鼠CD49b單抗，與細(xì)胞輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，加2 mL含1%FBS PBS，300×g離心5 min，棄上清液，再加入0.5 mL含1%FBS PBS重懸細(xì)胞，用FACS Calibur流式細(xì)胞儀，Cell Quest Pro軟件獲取細(xì)胞分析檢測。

2.4? Western blot檢測腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-1、2和p-p38、p-JNK蛋白表達

常規(guī)勻漿、裂解、離心提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白量，并用組織裂解液將各樣品調(diào)至相同濃度。進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液室溫封閉2 h，分別加入1∶1000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST液洗膜3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。TBST液洗膜3次，加入化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液，ECL曝光成像。用Image J軟件進行蛋白灰度分析。

3? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析或非參數(shù)檢驗，組間兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 小鼠一般狀況

接種第5日，小鼠右側(cè)腋窩皮下觸及黃豆粒大小腫塊，第7日瘤體生長明顯加快。隨著瘤體的生長，各組均逐漸出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)脫落、毛發(fā)缺少光澤、聚集、反應(yīng)遲緩和進食量減少等現(xiàn)象。與模型組、順鉑組比較，中藥組小鼠更具活力，一般狀況優(yōu)于模型組和順鉑組，生存質(zhì)量相對較好。中藥組于第5日1只小鼠死亡，考慮為灌胃不當(dāng)，誤入肺部導(dǎo)致窒息而死。

4.2? 二陳湯加沙參、麥冬對模型小鼠抑瘤率的影響

與模型組比較，中藥組和順鉑組小鼠瘤質(zhì)量均顯著降低（P<0.05，P<0.01）;順鉑組與中藥組比較小鼠瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。中藥組和順鉑組抑瘤率分別為33.64%、46.53 %。結(jié)果見表1。

4.3? 二陳湯加沙參、麥冬對模型小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響

與模型組比較，中藥組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P<0.05），脾指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與順鉑組比較，中藥組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P<0.05），脾指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

4.4? 二陳湯加沙參、麥冬對模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群的影響

與模型組比較，中藥組小鼠CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD4+/CD8+、B細(xì)胞水平均顯著升高（P<0.05，P<0.01），NK細(xì)胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），順鉑組小鼠CD8+細(xì)胞水平升高（P<0.05）;與順鉑組比較，中藥組小鼠CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞水平均顯著升高（P<0.05，P<0.01），CD4+/CD8+、B細(xì)胞及NK細(xì)胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

4.5? 二陳湯加沙參、麥冬對模型小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-1、2和p-p38、p-JNK蛋白表達的影響

與模型組比較，中藥組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR）-2、p-JNK蛋白表達顯著降低（P<0.05），VEGFR-1、p-p38蛋白表達無明顯變化（P>0.05）;與順鉑組比較，中藥組小鼠VEGFR-2、p-p38、p-JNK蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），VEGFR-1蛋白表達表達無明顯變化（P>0.05）。結(jié)果見圖1、圖2。

5? 討論

二陳湯君以半夏，燥濕化痰、降逆和胃;臣以橘紅，理氣健脾;佐以茯苓入脾經(jīng)，健脾滲濕;生姜助君臣降逆化痰和胃，佐制半夏之毒;烏梅斂肺氣、止久嗽，使痰祛而正不傷;使以甘草調(diào)和諸藥，健脾益氣和中。沙參和麥冬是王沛教授臨床常應(yīng)用于肺癌治療的兩味中藥，有養(yǎng)陰潤肺生津功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，沙參不但在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用，同時還在抗腫瘤方面療效顯著[10];麥冬有增強免疫功能、抗炎、抗腫瘤等作用[11]。

免疫功能低下或失調(diào)是惡性腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)因素。脾臟和胸腺是人體重要的免疫器官，是T淋巴細(xì)胞成熟、增殖和分化的主要部位，其臟器指數(shù)可作為衡量機體非特異性免疫功能的指標(biāo)之一[12]。細(xì)胞免疫是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的，T淋巴細(xì)胞亞群分析對判斷機體免疫功能具有重要作用。CD3+T細(xì)胞代表總T細(xì)胞水平，反映機體總的細(xì)胞免疫狀態(tài)。根據(jù)其表面標(biāo)志物，T淋巴細(xì)胞通常分為CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群[13]。一般認(rèn)為，CD4+T淋巴細(xì)胞可提高免疫，CD8+T淋巴細(xì)胞則有抑制作用。CD4+T與CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量相互調(diào)整以維持動態(tài)平衡，免疫功能處于穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)其下降甚至倒置時，機體免疫功能處于抑制狀態(tài)[14]。體液免疫由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，在機體受到抗原刺激后，B細(xì)胞可分化為漿細(xì)胞，合成和分泌抗體，在體液免疫中發(fā)揮作用。Sorrentino等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，在缺乏B細(xì)胞的肺癌鼠模型中，腫瘤生長速度加快。NK細(xì)胞又稱自然殺傷細(xì)胞，不需要預(yù)先接觸抗原，不依賴胸腺、抗體或補體，可直接發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，是抵抗腫瘤生長的第一道防線。趙輝等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者外周血中NK細(xì)胞含量顯著降低，且造成癌細(xì)胞增殖活力增強、血清中腫瘤標(biāo)志物含量升高。

腫瘤血管生成是腫瘤快速生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其病理過程受多方面因素影響。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是目前研究發(fā)現(xiàn)的腫瘤血管新生過程的主要驅(qū)動因子。VEGFR是VEGF發(fā)揮生物學(xué)作用的門戶，VEGFR-1和VEGFR-2主要表達于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是VEGF家族成員主要結(jié)合的兩種受體[17]。研究表明，VEGFR-1和VEGFR-2表達降低代表腫瘤新生血管受到抑制[18-20]。近年研究表明，多種細(xì)胞因子均參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展[21-22]。MAPK通路是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。JNK與p38是MAPK通路的兩大主要成員[23]，在受到細(xì)胞因子等多種刺激因素刺激后，JNK被激活磷酸化進而增強c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和凋亡蛋白的表達發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[24]。p38是絲氨酸/蘇氨酸激酶高度相關(guān)的蛋白激酶超家族，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)[25]。p38與JNK一樣，均屬應(yīng)激活化蛋白激酶。據(jù)報道，在多種腫瘤中觀察到JNK與p38活性升高[21，26-28]，而抑制JNK與p38通路可抑制腫瘤生長、促進腫瘤細(xì)胞凋亡，提示JNK與p38通路激活可能與腫瘤發(fā)生與增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)[29-31]。有文獻報道，蜂毒穴位注射對腫瘤血管的抑制作用可能是通過抑制JNK信號通路的表達實現(xiàn)的[32]，芹菜素抑制血管生成的作用可能與下調(diào)p-p38蛋白有關(guān)[33]。

本研究結(jié)果顯示，中藥組Lewis肺癌小鼠生存質(zhì)量優(yōu)于模型組和順鉑組，且二陳湯加沙參、麥冬可提高Lewis肺癌小鼠胸腺指數(shù)、CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+及B細(xì)胞水平，提示二陳湯加沙參、麥冬能提高小鼠免疫功能。但本研究用藥時間較短，而免疫治療的優(yōu)勢在長期用藥過程中更能體現(xiàn)，若能增加用藥時間，可能會取得更好的療效。與順鉑組比較，中藥組胸腺指數(shù)及T淋巴細(xì)胞亞群水平均顯著升高，但抑瘤率低于順鉑組，提示其較傳統(tǒng)化療藥物在提高Lewis肺癌小鼠免疫功能方面更有優(yōu)勢，但在降低瘤體質(zhì)量方面不及順鉑。在下一階段實驗中，我們將對腫瘤體積和瘤體質(zhì)量變化進行動態(tài)觀察，以完善抗腫瘤研究的觀察指標(biāo)。綜合來看，二陳湯加沙參、麥冬可提高Lewis肺癌小鼠免疫功能，從而增強自身抗腫瘤能力，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)二陳湯加沙參、麥冬可降低腫瘤組織VEGFR-2蛋白的表達，說明其對腫瘤血管生成有一定的抑制作用，且在抑制VEGFR-2的同時可顯著降低腫瘤組織p-JNK蛋白表達，提示其可能是通過抑制JNK磷酸化這一途徑發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用的;同時，其p-p38蛋白表達有下降趨勢，且較順鉑組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示二陳湯加沙參、麥冬可能對p38通路也有一定的作用，但有待在擴大樣本量和重復(fù)次數(shù)的基礎(chǔ)上進一步深入研究。本研究未設(shè)置二陳湯加沙參、麥冬不同劑量組及二陳湯原方組，未能探討其抗腫瘤作用是否具有量效關(guān)系及其與二陳湯原方抗腫瘤作用的差異，這是我們今后研究的重點之一。

綜上，二陳湯加沙參、麥冬具有提高Lewis肺癌小鼠免疫功能和抗腫瘤血管生成作用，抑制VEGFR-2表達、降低p-JNK活性可能是其抗腫瘤作用的機制。

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（收稿日期：2019-01-26）

（修回日期：2019-02-27;編輯：華強）