范媛媛 左紹遠(yuǎn)

摘要 多糖的分離純化是多糖研究的重要組成部分，多糖具有多種生物學(xué)活性，其中抗腫瘤是多糖的主要活性之一。多糖抗腫瘤機(jī)制大多與其免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)，通過總結(jié)相關(guān)文獻(xiàn)，綜述了近幾年多糖的提純方法、抗腫瘤活性及其作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞 多糖；分離純化；抗腫瘤；免疫調(diào)節(jié)

中圖分類號 Q946.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0023-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.007

Abstract The extraction and purification of polysaccharides is an important part of polysaccharide research.

Polysaccharides have many biological activities， among which antitumor is one of the main activities of polysaccharides.

The antitumor mechanism of polysacchrides is mostly related to immune regulation.

The purification methods， antitumor activity and mechanism of polysaccharides in recent years were reviewed by summing up the literature.

Key words Polysaccharide；Separation and purification；Antitumor；Immune regulation

多糖廣泛存在于動物、植物及微生物的細(xì)胞壁中，常由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而形成高分子聚合物。多糖不僅是組織細(xì)胞的重要組成成分，其在細(xì)胞識別、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分化、凋亡等過程中均發(fā)揮重要作用。研究表明，不同來源的多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種生物學(xué)活性。其中抗腫瘤活性是多糖的主要活性之一，也是近幾年多糖研究領(lǐng)域的前沿問題。筆者通過總結(jié)近幾年的相關(guān)文獻(xiàn)，對多糖的提純方法、抗腫瘤作用進(jìn)行綜述。

1 多糖的提取

多糖的提取方法有多種，主要有水提法、酶提法、超聲波提取法、微波輔助提取法等，可根據(jù)不同的原料來源選擇合適的方法。

1.1 水提法

多糖大都溶于水，且隨著溫度的提高提取效率也提高[1]，但水溫一般應(yīng)控制在80℃以下，否則會導(dǎo)致糖苷鍵的斷裂而破壞多糖的結(jié)構(gòu)。水提法操作流程不復(fù)雜，成本較低，通?？色@得較滿意的提取效率，因此，目前熱水浸提法在多糖分離提取中得到廣泛應(yīng)用。

左紹遠(yuǎn)等[2]在研究紅花蜂花粉多糖時(shí)用水提醇沉法提取多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測定多糖含量為86.12%，多糖提取率為2.85%。羅永會等[3]用水提法對慈姑進(jìn)行提取多糖，最佳工藝條件：提取時(shí)間3 h，溫度70 ℃，料水比1∶15，提取2次，多糖提取率達(dá)12.94%。曾婷等[4]應(yīng)用熱水浸提法提取仙茅粗多糖。仙茅干粉經(jīng)乙醇脫脂處理后，加入35倍的蒸餾水煮沸水浴2.5 h，提取液進(jìn)行抽濾，殘?jiān)僦貜?fù)以上步驟提取2次，濾液合并用95%乙醇沉淀過夜，65 ℃真空干燥得到仙茅粗多糖，采用硫酸-苯酚法測定仙茅多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.8%。

1.2 酶提法

酶法提取多糖可分為單一酶提取法和復(fù)合酶提取法。吳素萍等[5]采用纖維素酶提取枸杞多糖，通過正交試驗(yàn)對酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量4種影響因素進(jìn)行研究，得到提取枸杞多糖的最佳工藝條件為加水量50 mL、pH 5.0、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間60 min、加酶量05%。在該條件下多糖得率為11.2%，而采用水提法多糖得率為81%。于翠芳等[6]采用復(fù)合酶提取法在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平的Box-Dehnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出復(fù)合酶提取法的最佳工藝，多糖得率為13.96%，與單一酶相比，在多糖得率上并無明顯優(yōu)勢，但其時(shí)間比單一酶縮短50%。滕利榮等[7]研究了熱水提法和復(fù)合酶提法的最佳條件，用纖維素酶、果膠酶、胰酶3種酶按比例加入百合塊莖干品中，選取pH、酶促反應(yīng)溫度和時(shí)間3個影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，在最適條件下，多糖提取率為31.03%，是熱水提法的285倍，且還對2種不同方法得到的多糖抗氧化活性進(jìn)行比較，酶法提取的多糖對O2-的清除率和對OH-的抑制作用均明顯高于水提法得到的多糖。

1.3 超聲波提取法

胡斌杰等[8]在提取靈芝多糖中應(yīng)用了超聲波法，將靈芝菌粉按一定條件（料液比、時(shí)間、溫度、粒度）超聲提取2次，過濾，濾液合并，醇沉，用苯酚-硫酸法測定多糖含量，在超聲波法提取溫度50 ℃、時(shí)間20 min、粒度40目，傳統(tǒng)熱水提法提取溫度80 ℃、時(shí)間1.5 h、粒度40目的條件下，超聲法提取率較熱水提取法提高了30%以上，而時(shí)間縮短了近75%。超聲法溫度適中，避免了高溫有可能對多糖有效成分的破壞，從而使多糖的生物活性得以保持。雖然超聲波提取法的提取率率優(yōu)于水提法，但超聲提取時(shí)間>20 min時(shí)，多糖的提取率會逐漸下降，可能是由于超聲波較長時(shí)間的機(jī)械剪切使多糖降解而導(dǎo)致[9]。

1.4 微波輔助提取法

微波輔助提取是一種利用微波能量來提取多糖的新技術(shù)，與超聲的作用原理相似。聶金媛等[10]采用微波輔助提取法提取茯苓多糖，選擇微波作用時(shí)間、占空比、固液比3個因素，每個因素確定15個水平，以U15均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，得出最佳提取工藝：微波作用時(shí)間18 min，占空比42%，固液比1∶50。在此條件下，茯苓多糖提取率為2.792%，相比水提法的多糖得率高1.35%。王麗等[11]采用微波法處理米糠多糖，通過單因素和正交試驗(yàn)最終得出微波輔助提取米糠多糖的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶10；微波輻射時(shí)間2 min；微波功率400 W，多糖提取率為276%，高于傳統(tǒng)水提多糖得率2.02%。黃璞等[12]為優(yōu)化黑靈芝孢子粉多糖的微波提取工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法和Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)的方法，研究提取溫度、提取時(shí)間以及水料比3個自變量及其交互作用對多糖提取率的影響。利用SAS和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型，并確定微波提取多糖最佳條件：溫度 129 ℃、時(shí)間 27 min、水料比為 31∶1。在此條件下，多糖提取率理論值為2.73%，實(shí)際值為2.64%，誤差較小。試驗(yàn)證明，微波輔助提取法提取效率高，試驗(yàn)時(shí)間短，可供選擇的溶劑較多，溶劑用量少，節(jié)能。此外，由于微波作用時(shí)間短，可有效避免長時(shí)間高溫操作對樣品造成的損壞，有利于熱不穩(wěn)定多糖的提取[13]。

2 多糖的分離純化

多糖的粗提物通常為糖蛋白，且常含有色素及小分子雜質(zhì)等，需進(jìn)行脫蛋白、脫色及透析去除小分子雜質(zhì)，可得總多糖?？偠嗵峭ǔＪ嵌喾N不同級分多糖的混合物，常需進(jìn)一步分離分級、純化，以便獲得均一的多糖組分。劉紅梅等[14]在北極海參多糖的分離純化及抗腫瘤活性研究中發(fā)現(xiàn)，3種精制多糖對4種腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于總多糖，提示多糖的均一性與活性密切相關(guān)。

2.1 脫蛋白、脫色

多糖的提純方法有多種，脫蛋白常用的方法有Sevage法、酶法、三氟三氯乙烷法、沉淀法、硫酸銨法等。去除色素的方法有活性炭吸附、濾膜超濾、過氧化氫法、離子交換樹脂法、反膠束法等。

Sevage法是最常用的方法之一。Sevage法去除蛋白是根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑變性而不溶于水的特點(diǎn)，將多糖水溶液、氯仿、戊醇或正丁醇按比例調(diào)成混合物振蕩，蛋白質(zhì)與氯仿-戊醇（正丁醇）生成凝膠物而分離的原理，以去除水層和溶劑層交界處的變性蛋白。程軒軒等[15]采用水提醇沉法提取白簕多糖，取白簕多糖水溶液，按4倍體積加入正丁醇-氯仿（1∶4）混合液振蕩離心取上層溶液，經(jīng)6次脫蛋白過程后得到蛋白脫出率/多糖保留率分別為31.84%/9544%、34.08%/93.61%、39.66%/89.14%、78.21%/8457%、79.33%/78.28%、79.33%/77.27%。Sevage法脫蛋白較溫和，可避免多糖降解，但脫蛋白效率不高，且多糖保留率隨脫蛋白次數(shù)增加而減少。常與酶法脫蛋白結(jié)合，可提高脫蛋白效率。

色素分為脂溶性和水溶性，脂溶性色素可在提取多糖前對原料進(jìn)行石油醚、乙醇回流，大部分脂溶性色素可去除。水溶性色素極易溶于水和乙醇，在醇沉步驟將其去除[16]。對殘留的色素可用透析、活性炭吸附等方法去除，熊偉等[16]采用活性炭吸附方法對螺旋藻粗多糖進(jìn)行脫色處理，由于活性炭是具有多空結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，因此能吸附多糖水溶液中的色素。

2.2 柱層析法

柱層析法作為常用提純方法之一，在分級純化多糖時(shí)應(yīng)用廣泛。曹永強(qiáng)等[17]采用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱純化植物乳桿菌胞外粗多糖，透析、冷凍干燥后得到SKT109胞外中性多糖和YW11胞外酸性多糖樣品，2種樣品經(jīng)過DEAE-Sepharose FastFlow離子交換柱層析，有可能會含有相同電荷的不同組分，再經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠柱純化，經(jīng)純化后的2種多糖純品的總多糖含量達(dá)92.31%、89.02%，純度較高。呂樂等[18]為研究葡萄樹傷流液多糖的抗氧化能力，采用DEAE-52纖維素柱對吐魯番無核白和喀什木納格葡萄樹傷流液中多糖進(jìn)行分離純化，得到8個均一多糖組分。

3 多糖抗腫瘤作用

惡性腫瘤一直是危害人身健康的重要疾病之一。目前腫瘤的治療常采取手術(shù)及放化療。但放化療存在較嚴(yán)重的免疫抑制和造血抑制的毒副作用。而多糖可抑制腫瘤生長且毒副作用小，具有較好的臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3.1 多糖的免疫調(diào)節(jié)作用

體內(nèi)眾多的免疫系統(tǒng)起著抗腫瘤的作用，而多糖則是一種免疫增強(qiáng)劑，不但能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、M 、NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞、LAK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）吞噬、清除老化細(xì)胞和異物以及病原體的作用，還能促進(jìn)IL-1、IL-2、TNF-α、INF-γ、NO等生成，調(diào)節(jié)機(jī)體抗體和補(bǔ)體的形成，提高機(jī)體抗腫瘤免疫力[19]。

3.1.1 激活T/B淋巴細(xì)胞、激活抗原呈遞細(xì)胞。

高向東[20]從海洋耐鹽炭團(tuán)菌（YC4108）提取得到Y(jié)CP1，將YCP1作用到荷瘤小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)YCP1對小鼠Heps實(shí)體瘤有明顯抑制作用，抑瘤率為50.2%。YCP1經(jīng)純化得到Y(jié)CP2和YCP3 2種多糖組分，雖然在體外對肝癌細(xì)胞SMMC（-）21無直接殺傷作用，但試驗(yàn)顯示2種組分可顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ和巨噬細(xì)胞IL-1和TNF-α的產(chǎn)生能力，并與劑量大小成正比。采用RF-PCR法來探究各組分多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示YCP2和YCP3能夠顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ及小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α基因表達(dá)水平。表明炭團(tuán)菌多糖的抗腫瘤作用與誘發(fā)免疫反應(yīng)及提高細(xì)胞因子表達(dá)水平有關(guān)。

抗原提呈細(xì)胞（DC）在抑制腫瘤、阻礙腫瘤進(jìn)行性浸潤方面有一定的作用，李明松等[21]將DC體外誘導(dǎo)的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）背部皮下注射回輸荷瘤裸鼠體內(nèi)，并對腫瘤細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)DC誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫主要是通過誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)。

3.1.2 激活巨噬細(xì)胞。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)一種能夠分泌細(xì)胞毒效應(yīng)分子并對腫瘤細(xì)胞與入侵到機(jī)體的外來病原微生物具有抑制或清除作用的免疫效應(yīng)細(xì)胞。但無活化的巨噬細(xì)胞，其吞噬殺傷作用是有限的。溶菌酶是正常體液中抗微生物的物質(zhì)之一，系巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞所產(chǎn)生，測定其含量可反映該類細(xì)胞非特異性免疫功能的強(qiáng)弱，云芝多糖能明顯增加小鼠血清溶菌酶含量，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的非特異性免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。香菇多糖能激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞毒作用，提高NKC活性，誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集發(fā)揮抗腫瘤作用[22]。海帶硫酸多糖能激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的過氧化物酶活性及其吞噬功能，從而抑制小鼠S180肉瘤[23]。

3.2 對腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用

楊瑾等[24]提取板橋黨參多糖研究抗腫瘤活性，對板黨多糖干預(yù)昆明小鼠的抑瘤率、安全性評價(jià)、體外增殖抑制3個方面進(jìn)行測評，結(jié)果表明當(dāng)板黨多糖劑量為100和200 mg/kg時(shí)，其抑瘤率分別為3416%、37.59%，雖然比環(huán)磷酰胺組抑瘤率低，但相對安全且無毒副作用，在體外增值抑制方面顯示，板黨多糖10 ug/mL對MCF-7細(xì)胞的抑制作用不明顯，100、500、1 000 ug/mL對MCF-7細(xì)胞的抑制率隨質(zhì)量濃度增加而升高，呈良好的質(zhì)量濃度依賴性，證明板黨多能夠直接抑制腫瘤細(xì)胞活性。還有學(xué)者研究牛膝多糖能提高荷瘤小鼠自然殺傷細(xì)胞（NKC）的活性，ABPS 100 mg/kg ip 能提高LPS誘導(dǎo)的TNF-α及NO的產(chǎn)生和NOS的活性，提高T-淋巴細(xì)胞增殖能力，并對腫瘤細(xì)胞起不同程度的殺傷和抑制作用[25]。

3.3 對癌基因的影響

p53作為公認(rèn)的抗癌基因，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，其表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)節(jié)作用，表達(dá)產(chǎn)物增多意味著癌細(xì)胞活性下降[26]。魏小龍等[27]利用Northern雜交和狹線雜交的定量檢測方法，發(fā)現(xiàn)低分子量（1 000～2 000 u）地黃多糖（LRPS）可使小鼠Lewis肺癌細(xì)胞內(nèi)的正調(diào)控基因c-fos基因表達(dá)明顯增加，負(fù)調(diào)控基因c-myc基因表達(dá)明顯減少，又采用RT-PCR的方法檢測體外多糖對p53基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果p53基因表達(dá)明顯增加。董蘭鳳等[28]采用附子多糖和酸性多糖以腹腔注射和灌胃2種給藥途徑對荷瘤小鼠（S180、H22）進(jìn)行抑瘤率研究，結(jié)果顯示2種多糖均提高了抑癌基因p53和Fas的表達(dá)，有顯著的抑瘤作用。

3.4 多糖改變腫瘤細(xì)胞膜的生長特性

多糖對腫瘤細(xì)胞膜的影響主要與唾液酸（SA）和磷脂（PI）轉(zhuǎn)換有關(guān)。SA位于細(xì)胞膜表面糖蛋白和糖脂的聚糖鏈末端，與細(xì)胞膜的許多功能有關(guān)，具有阻礙病原體附著細(xì)胞及使細(xì)胞產(chǎn)生免疫抗體的作用。腫瘤細(xì)胞膜SA含量的降低，與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、相關(guān)抗原的表達(dá)和免疫應(yīng)答細(xì)胞的過程相關(guān)。PI轉(zhuǎn)換是指存在于細(xì)胞膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的磷脂酸肌醇在其激酶催化下發(fā)生磷酸化反應(yīng)的過程[26]。周永[19]從大腸桿菌中提取的莢膜多糖能抑制B16-BL16黑色素瘤細(xì)胞及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并能降低B16-BL16對內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞間的黏附分子、選擇性蛋白的黏附作用。

4 展望

先進(jìn)的提取、分離、純化技術(shù)的發(fā)展，將極大地提高多糖的分離純化效率。多糖可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯等機(jī)制而直接抑制腫瘤細(xì)胞生長，同時(shí)可作為免疫增強(qiáng)劑，通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，多糖作為一種潛在的新抗腫瘤藥物資源，具有良好的應(yīng)用前景。

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