幾種深色食物中原花青素含量及抗氧化活性的測(cè)定和比較

卜得新，張方艷，朱桂蘭，郭 娜，魯紅俠

（合肥師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 236001）

原花青素，通常別稱(chēng)為縮合單寧，是類(lèi)似黃酮一樣的由黃烷-3-醇單體慢慢縮小合成得到的聚多酚類(lèi)地物質(zhì)，還具有生物活性[1]。它普遍存在于植物的葉子、皮、果食、根中[2]，尤其是深色的食物，所以研究原花青素與色澤的關(guān)系可以更好地在外觀上判別食品中原花青素的含量。維C、維E是比較常見(jiàn)的抗氧化活性物質(zhì)，但實(shí)際上原花青素比這2個(gè)的抗氧化活能力要高得多，去除人體存在的自由基效果也很好，而且能夠防止因自由基導(dǎo)致的很多疾病，如心臟方面的疾病、關(guān)節(jié)炎等，所以它是一種很好的天然抗氧化劑[3]。因其抗氧化活性好，所以在保健品和化妝品領(lǐng)域中應(yīng)用比較廣泛。研究原花青素的抗氧化活性和測(cè)定其在食物中的含量能夠更好地了解和利用原花青素來(lái)保健和預(yù)防一些疾病。

藍(lán)莓、紫薯和巨峰葡萄這3種深色食品中含有大量的原花青素，并且藍(lán)莓中原花青素的含量?jī)H比公認(rèn)第一的新鮮黑枸杞低一些。目前，在工業(yè)上對(duì)藍(lán)莓、紫薯和葡萄的利用較多，在生活中這3種深色的食物也因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而深受廣大消費(fèi)者的喜歡，而這三者的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就是來(lái)源于其中的生物活性物質(zhì)——原花青素。試驗(yàn)利用3種深色物質(zhì)來(lái)測(cè)定其原花青素的含量，并比較三者的抗氧化性。高效液相色譜儀不但具有快速分離、極強(qiáng)的靈敏性和高度的自動(dòng)化等方面的優(yōu)勢(shì)，還比一般的測(cè)定方法簡(jiǎn)單快速[4]。主要利用高效液相色譜儀來(lái)測(cè)定藍(lán)莓、紫薯和葡萄這3種深色食物中原花青素的含量，并比較三者對(duì)超氧陰離子自由基的斷根效率[5]、DPPH自由基斷除效果[6]，以及OH自由基的斷除效率[7]的檢測(cè)，旨在為人們的生活和生產(chǎn)提供一定的依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓，采自合肥師范學(xué)院藍(lán)莓基地；紫薯、巨峰葡萄，購(gòu)買(mǎi)于禹州華僑城誼品生鮮超市。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（＞98%）、甲醇試劑（色譜純）、磷酸（色譜純）、甲醇、無(wú)水乙醇、鄰苯三酚、雙蒸水、Tris-HCl（pH值8.2）、DPPH試劑、過(guò)氧化氫、水楊酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-1260型安捷倫高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司產(chǎn)品；LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī)，北京松原華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；722S型分光光度計(jì)、FA1104N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；80-1型離心機(jī)，杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；HH-S型恒溫水浴鍋，國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；CR-400型色差儀，柯尼卡美達(dá)能中國(guó)投資有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料的預(yù)處理[8-15]

取新鮮的藍(lán)莓、紫薯和巨峰葡萄，將3種深色食物進(jìn)行清洗，葡萄去籽，再將3種深色食物放入攪碎機(jī)中分別攪碎，將攪碎后的樣品放入低溫冷凍冰箱預(yù)冷20 h，最后利用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)樣品干燥48 h后留著備用。

稱(chēng)取2 g樣品放在50 mL的棕色容量瓶中，加入30 mL的甲醇，利用超聲提取20 min，冷卻至室溫，再用甲醇定容到50 mL，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，重復(fù)2次，取上清液留著備用[4]。

1.3.2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱(chēng)取10 mg（精確到0.01 mg） 原花青素的標(biāo)準(zhǔn)品，放在10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇溶解并且定容至10 mL刻度線，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確的吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.10，0.25，0.50，1.00，2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容到刻度線，搖晃均勻。然后各個(gè)質(zhì)量濃度吸取1.0 mL進(jìn)行反應(yīng)，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，做出回歸方程進(jìn)行計(jì)算[4，16]。最后將3種樣品上機(jī)操作，調(diào)節(jié)合適的色譜條件，根據(jù)高效液相色譜儀出的色譜圖上對(duì)應(yīng)的峰面積代入回歸方程，即可求出3種樣品中原花青素的含量。

1.3.3 原花青素含量的測(cè)定

精確調(diào)節(jié)色譜條件如下：耐低pH型C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）[17]，柱溫30℃，流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸（27∶73，V/V）[4]，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)525 nm，將3種樣品進(jìn)機(jī)操作，測(cè)出峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出三者含量。

1.3.4 對(duì)超氧陰離子自由基的檢測(cè)

先將質(zhì)量濃度為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL各1 mL的3種樣品溶液放到有刻度的試管里，再加入5 mL Tris-HCl（pH值8.2） 緩沖液，用雙蒸水定容至9.7 mL，放于25℃條件下水浴保溫20 min，加到25℃預(yù)熱0.3 mL的濃度為3 mmol/L鄰苯三酚溶液中，于波長(zhǎng)320 nm處每隔60 s測(cè)定吸光度1次，共測(cè)9 min[18]。計(jì)算3種待測(cè)溶液吸光度隨時(shí)間的變化率Fx。以1 mL蒸餾水代替上述過(guò)程中的3種待測(cè)溶液，計(jì)算出空白對(duì)照溶液吸光度隨時(shí)間的變化率F0。按下列公式計(jì)算超氧陰離子自由基清除能力[5]。

公式：F0——空白對(duì)照溶液的吸光度隨時(shí)間的變化率；

Fx——樣品溶液的吸光度隨時(shí)間的變化率。

1.3.5 DPPH自由基清除率的檢驗(yàn)

分別吸取2.5 mL質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.05，0.08，0.10 mg/mL樣品提取液與比色管中，加入2.5 mL濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液充分混勻，反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度Ai，另外各取2.5 mL的上述質(zhì)量濃度樣品提取液與比色管中，加入2.5 mL無(wú)水乙醇混勻，測(cè)其吸光度Ab，另取2.5 mL DPPH溶液與2.5 mL無(wú)水乙醇反應(yīng)做參比，記錄其吸光度為Ac，同時(shí)測(cè)定維C對(duì)DPPH自由基清除率作為對(duì)比。

公式：Ai——樣品與DPPH混合液的吸光度；

Ab——樣品溶液與無(wú)水乙醇混合液的吸光度；Ac——無(wú)水乙醇與DPPH混合液的吸光度。

1.3.6 OH自由基清除率的測(cè)定

分別吸取質(zhì)量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL各1 mL的3種樣品溶液中依次加入3 mL濃度為7.5 mmol/L FeSO4，3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%H2O2搖勻后加入3 mL濃度為6 mmol/L水楊酸，搖勻并在37℃的水浴鍋中加熱15 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度Ay，再利用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇代替H2O2溶液，加入上述溶液并用相同的方法測(cè)定吸光度為Am，再利用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇代替樣品溶液，測(cè)出吸光度為A0；最后用下列的公式計(jì)算OH自由基的清除率。

式中：A0——空白樣品對(duì)照吸光度；

Ay——加待測(cè)樣品吸光度；

Am——代替H2O2溶液測(cè)定的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系式為Y=4 548.957 06X+8.410 72，R2=0.995 18相關(guān)性良好。

2.2 3種樣品中原花青素測(cè)定的結(jié)果

運(yùn)用高效液相色譜儀，在適當(dāng)?shù)纳V條件下，檢測(cè)出紫薯樣品對(duì)應(yīng)的高效液相色譜圖。

紫薯樣品高效液相色譜圖見(jiàn)圖2，巨峰葡萄樣品高效液相色譜圖見(jiàn)圖3，藍(lán)莓樣品高效液相色譜圖見(jiàn)圖4。

圖2 紫薯樣品高效液相色譜圖

圖3 巨峰葡萄樣品高效液相色譜圖

圖4 藍(lán)莓樣品高效液相色譜圖

由圖2可知，樣品所對(duì)應(yīng)峰面積為Y=1 974.167 4，將其帶入關(guān)系式Y(jié)=4 548.957 06X+8.410 72中，可以得出X=0.432 mg/mL。所以，樣品紫薯中原花青素的質(zhì)量濃度為0.432 mg/mL。利用同種方法根據(jù)圖3和圖4的數(shù)據(jù)可以測(cè)出巨峰葡萄和藍(lán)莓樣品中的原花青素分別為0.128，0.726 mg/mL。由數(shù)據(jù)可知，藍(lán)莓樣品提取液中的原花青素含量最高，其次是紫薯樣品中的原花青素，原花青素含量最低的是巨峰葡萄樣品。經(jīng)查看相關(guān)資料[3]可知，藍(lán)莓原花青素存在于整個(gè)果實(shí)中，且含量很高，紫薯果皮中含有大量原花青素，但是果肉中淀粉含量很高，原花青素含量不高，所以整體沒(méi)有藍(lán)莓原花青素含量高，巨峰葡萄的原花青素主要存在于果皮中，果肉中大部分為多糖和水分，所以與藍(lán)莓和紫薯比較起來(lái)，巨峰葡萄中的原花青素含量最低。

2.3 對(duì)超氧陰離子自由基清除率測(cè)定的結(jié)果

3種深色樣品中原花青素對(duì)超氧陰離子斷根結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 3種深色樣品中原花青素對(duì)超氧陰離子斷根結(jié)果

由圖5可知，在質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí)3種原花青素提取液對(duì)超氧陰離子的去除率最小，并且隨著質(zhì)量濃度的增大，整個(gè)圖像呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，達(dá)到最大清除率的原花青素含量是0.1 mg/mL。相關(guān)研究表明，在堿性環(huán)境下，鄰苯三酚本身會(huì)產(chǎn)生氧化反應(yīng)生成超氧陰離子，與原花青素產(chǎn)生相合，并且隨著原花青素質(zhì)量濃度的升高，對(duì)產(chǎn)生的超氧陰離子的斷除效率也提升；原花青素的樣品對(duì)超氧陰離子自由基的斷除效率依次為藍(lán)莓＞紫薯＞巨峰葡萄。

2.4 DPPH自由基去除率的檢測(cè)結(jié)果

3種原花青素提取液對(duì)DPPH自由基清除率見(jiàn)圖6。

由圖6可知，3種深色食品中的原花青素對(duì)去除DPPH自由基的能力都好于維C，經(jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，原花青素去除自由基的能力比維C要強(qiáng)些。隨著樣品中原花青素的質(zhì)量濃度變高，DPPH自由基的斷除結(jié)果也在不斷變大，說(shuō)明質(zhì)量濃度與DPPH自由基的去除率有一定的關(guān)系。但是，就3種樣品中的原花青素做對(duì)比可以看出，三者對(duì)DPPH自由基的去除效果都相差不明顯，結(jié)合誤差棒可以看出，數(shù)據(jù)的不明確性很大，可能因?yàn)樵跍y(cè)量吸光度時(shí)，對(duì)時(shí)間和溫度沒(méi)有把控好。相關(guān)資料表示，原花青素的穩(wěn)定性與溫度有關(guān)聯(lián)，所以產(chǎn)生較大的誤差，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有所偏差[7]。

圖6 3種原花青素提取液對(duì)DPPH自由基清除率

2.5 OH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

3種不同質(zhì)量濃度原花青素提取液對(duì)OH自由基清除率見(jiàn)圖7。

圖7 3種不同質(zhì)量濃度原花青素提取液對(duì)OH自由基清除率

由圖7可知，隨著3種原花青素提取液質(zhì)量濃度的增大，整個(gè)圖像呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并且原花青素對(duì)OH自由基清除率的大小依次為藍(lán)莓＞紫薯＞巨峰葡萄。相關(guān)資料表明，原花青素濃度與OH自由基的去除效果存在明顯的關(guān)系，原花青素的濃度越大，對(duì)OH自由基的去除效果也就越明顯。

3 結(jié)論

隨著經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)和科技的發(fā)展，在解決了糧食短缺等問(wèn)題后，人們?cè)絹?lái)關(guān)注保養(yǎng)和健康。原花青素的抗氧化性除了可以預(yù)防許多疾病，也可以起到美容和保健的作用。試驗(yàn)利用生活中常見(jiàn)的3種深色食品為原材料提取原花青素，測(cè)定并比較其含量與抗氧化活性。結(jié)果表明，原花青素含量依次為藍(lán)莓＞紫薯＞巨峰葡萄；原花青素質(zhì)量濃度與3種自由基都存在正相關(guān)的聯(lián)系，對(duì)超氧陰離子自由基和OH自由基清除能力依次為藍(lán)莓＞紫薯＞巨峰葡萄，去除DPPH自由基的能力相近，明顯比維C強(qiáng)。

試驗(yàn)提取原花青素時(shí)，因?yàn)樽鲜砗途薹迤咸阎蟹謩e含有大量的淀粉和多糖，所以得到提取液中不止是原花青素，并且還含有其他物質(zhì)，對(duì)抗氧化活性試驗(yàn)有一定干擾，進(jìn)而對(duì)抗氧化活性試驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生了一定偏差?？梢?xún)?yōu)化去除其中的淀粉和多糖，將提取液中原花青素盡可能地提取出來(lái)。