李 甘，夏大靜

1楚雄州人民醫(yī)院輸血科，楚雄 675000；2浙江大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，杭州 310058

糖基化終末代謝產(chǎn)物(AGEs)是葡萄糖與各種蛋白質(zhì)、核酸或脂質(zhì)大分子在非酶的條件下形成的糖基化代謝產(chǎn)物，該反應(yīng)在體內(nèi)可緩慢進(jìn)行，隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加，而在糖尿病或尿毒癥患者中該反應(yīng)速度顯著加快，形成量明顯增多。AGEs可以通過多種機(jī)制對(duì)全身許多組織及器官產(chǎn)生損害，在糖尿病中研究較多，被認(rèn)為是糖尿病血管病變的觸發(fā)因素[1]。AGEs通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以使其結(jié)構(gòu)和功能受到影響。有多種阻止AGEs累積與形成的治療方法，降糖藥如二甲雙胍[2]、氨基胍類化合物、ALT 946吡哆胺(pyridoxamine)等[3]，它們分別可以通過不同途徑阻滯AGEs形成，而AGEs裂解劑可以裂解已經(jīng)形成的AGEs交聯(lián)結(jié)構(gòu)。有研究表明[4]，AGEs抑制劑以及AGEs交聯(lián)結(jié)構(gòu)裂解劑，可以從不同的階段阻斷AGEs的形成，特別是AGEs裂解劑能夠逆轉(zhuǎn)或軟化由AGEs造成的組織、器官以及血管的硬化，有希望成為一類新型治療藥物，尤其針對(duì)眼底和腎組織的終末血管變化。

秦皮甲素(Esculin)為木犀科植物苦櫪白蠟樹(FraxinusrhynchophyllaHance)、白蠟樹(FraxinuschinensisRoxb.)、尖葉白蠟樹(FraxinusszaboanaLingelsh)或宿柱白蠟樹(FraxinusstylosaLingelsh.)等4種干燥枝皮或干皮提取物。最早見于漢代的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》，中國(guó)《本草綱目》對(duì)該味藥的表述為：“秦皮，治目病，驚癎，取其平木也?！蓖瑫r(shí)也有《淮南子》：“秦皮色青，治目之要藥也”?，F(xiàn)代藥理研究表明[5]，秦皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、降低尿血酸、抗凝、止咳祛痰平喘以及抗腫瘤作用，主要用于治療腸炎、痢疾、白帶、慢性氣管炎、結(jié)膜炎，用于治療痛風(fēng)效果甚佳。秦皮中主要成分為香豆素類(含秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素、宿柱白蠟苷、6，7-二甲氧基香豆素等)[6]，此外還有酚類、皂苷和鞣質(zhì)等。秦皮甲素可以改善鏈脲菌素(Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血脂異常、炎癥反應(yīng)、以及腎損傷[7]。有文獻(xiàn)證明AGEs通過損傷內(nèi)皮細(xì)胞可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，最終引起糖尿病等血管并發(fā)癥的發(fā)生[8]。基于糖尿病以及終末腎病中AGEs的大量生成及所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用AGEs作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(ECV304)，模擬糖基終末化產(chǎn)物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，并用秦皮甲素干預(yù)，觀察對(duì)ECV304增殖和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。考察秦皮甲素對(duì)AGEs損傷后內(nèi)皮細(xì)胞功能的研究，探討其機(jī)制是否與抑制糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的生物學(xué)活性有關(guān)，將有助于進(jìn)一步闡明秦皮甲素是否存在潛在的血管保護(hù)作用，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

秦皮甲素，成都曼思特生物科技有限公司(貨號(hào)：A0020，純度：HPLC≥98%)；無水乙醇，北京化學(xué)試劑廠；青霉素，華北制藥有限公司；鏈霉素，華北制藥有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號(hào)：20180326)、活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒(化學(xué)熒光法)(批號(hào)：20180326)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)：20180326)、一氧化氮(NO)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20180326)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號(hào)：20180326)、甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20180326)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)(批號(hào)：20180326)、總膽固醇(CHO)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20180326)均由南京建成生物工程研究所提供；非對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)檢測(cè)試劑盒為美國(guó)CUSABIO公司提供(批號(hào)：CSB-E09298h)；ECV304細(xì)胞為寧波醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所藥理室贈(zèng)送，經(jīng)免疫熒光鑒定，eNOS和vWF均為陽性；DMEM培養(yǎng)基，Trypsin，胎牛血清 (FBS)均購自Life technology公司；溴乙錠(EB)、CCK-8為Dojindo產(chǎn)品；二甲亞砜購自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；Trizol試劑購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄及SYBR Green I Real Time PCR試劑購自大連寶生物公司；引物由GENEWIZ(金唯智)合成;血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子-1(VCAM-1，貨號(hào)：ab212937)和細(xì)胞間粘附因子1(ICAM-1，貨號(hào)：ab171123)抗體均為Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AGEs的制備

參照文獻(xiàn)的方法[9]，用凍干牛血清白蛋白和糖制備無內(nèi)毒素的糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE-BSA)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

ECV304的培養(yǎng)液為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，用0.25% 的胰蛋白酶消化傳代后，將ECV304置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，2天換液1次。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為第6～8代。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以150 μL/孔接種于96孔板，細(xì)胞數(shù)2×104/孔，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，再孵育24小時(shí)使細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)入休止期(同步化)。吸棄上清液，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，分別加入不同濃度的AGEs達(dá)到終濃度(0、25、50、100、150、200、250 mg/L)，培養(yǎng)24小時(shí)，CCK-8法觀察不同濃度AGEs對(duì)ECV304增殖的影響。同一水平6孔并列，在加入終濃度為200 mg/L AGEs的同時(shí)分別給予終濃度為2.5 、5、10、15、20、25 mg/L的秦皮甲素溶液，并設(shè)AGEs培養(yǎng)組和DMEM對(duì)照組。在37 ℃飽和濕度5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)。取出后，每孔加入16.7 μL CCK-8溶液，37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm時(shí)的光密度值[D(450)值]。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)及其相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

按照試劑盒說明書收集細(xì)胞和培養(yǎng)基上清檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)： ROS、MDA、LDH、LDL、CHO、TG。對(duì)細(xì)胞裂解物中的SOD進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 血管粘附分子檢測(cè)

免疫印跡檢測(cè)VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)水平，過程如下：細(xì)胞在AGEs和秦皮甲素共同孵育24小時(shí)，使用RIPA法裂解，收集細(xì)胞裂解液。裂解后，取3 μL裂解液用于二喹啉甲酸法(BCA)定量。蛋白樣品95 ℃孵育10分鐘變性處理，變性后的蛋白-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽?0%的SDS-page膠，進(jìn)行電泳分離。蛋白分離后經(jīng)200 mA恒流1.5小時(shí)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，使用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1小時(shí)，與一抗4 ℃孵育過夜，次日加入內(nèi)參抗體β-actin室溫孵育1小時(shí)，洗膜后加入含二抗室溫作用1小時(shí)后，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發(fā)光液，暗室中壓片顯影。使用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化分析，ELISA法確定樣本基本濃度。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)

收集細(xì)胞，參照Trizol試劑說明裂解細(xì)胞后提取RNA。引物序列見表1。實(shí)時(shí)定量PCR 25 μL反應(yīng)體系由以下成份組成：12.5 μL 2 × Power SYBR Green PCR Master Mix，1.0 μmol/L 上、下游引物，1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，超純水構(gòu)成。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10分鐘；循環(huán)反應(yīng)為95 ℃ 8 s，60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)，在各循環(huán)的60 ℃ 40 s步驟進(jìn)行熒光檢測(cè)；最后為融解曲線步驟。每個(gè)樣品目的基因的表達(dá)域值與其內(nèi)參基因表達(dá)域值的差ΔCt為其相對(duì)表達(dá)量。以2-ΔCt表示為目的基因在藥物處理組的表達(dá)量與在正常組表達(dá)量的比值。

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)基因的引物序列

1.2.7 NO以及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

應(yīng)用Griess法對(duì)細(xì)胞上清液中NO水平進(jìn)行檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)ADMA進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格遵循說明書實(shí)施。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均值及標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)結(jié)果采用Prism6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。組間具有方差齊性時(shí)，組間比較使用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素ANOVA分析，方差不齊者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秦皮甲素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

AGEs作用ECV304細(xì)胞24小時(shí)后，如圖1A所示，與空白對(duì)照組相比，當(dāng)AGEs濃度高于50 mg/L時(shí)，其存活率顯著降低(P<0.05)。由圖1B可知，不同濃度(2.5、5、10、15、20、25 mg/L)秦皮甲素作用于AGEs致ECV304損傷的細(xì)胞，當(dāng)秦皮甲素的濃度高于15 mg/L時(shí)對(duì)AGEs致?lián)p的ECV304細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用(P<0.05)，同時(shí)呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖1 秦皮甲素削弱AGEs對(duì)ECV304細(xì)胞抑制效應(yīng)Fig.1 Esculin diminished the inhibitory effect of AGEs on ECV304 cells注：A：AGEs對(duì)ECV304細(xì)胞增殖的影響；B：甲素對(duì)AGEs致ECV304損傷影響。*代表與BSA組比較，P<0.05。Note:A:the effect of AGEs on the proliferation of ECV304 cells.B:the effect of esculin on AGEs-treated ECV304 cells.*Compared with the control group,P<0.05.

圖2 秦皮甲素對(duì)AGEs誘導(dǎo)ROS形成的影響 Fig.2 Effect of esculin on ROS formation induced by AGEs 注：A：200 mg/L AGEs作用不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)ROS的水平；B：不同濃度AGEs對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成的影響；C：秦皮甲素作用不同時(shí)間后對(duì)ECV304細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響；D：秦皮甲素對(duì)AGEs作用后ECV304細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。*代表與control組比較，P<0.05 #代表與control組比較，P<0.05。Note:A:The level of intracellular ROS at different time after treatment with 200 mg/L AGEs.B:The effect of different concentrations of AGEs on the production of ROS in cells.C:The effect of esculin on ROS production in ECV304 cells at different time.D:The effect of esculin on ROS levels in ECV304 cells after AGEs treatment.*Compared with the control group,P<0.05.# Compared with the AGEs model group, P<0.05.

2.2 秦皮甲素對(duì)AGEs 誘導(dǎo)的活性氧以及相關(guān)酶的影響

測(cè)定秦皮甲素對(duì)AGEs致?lián)p的ECV304細(xì)胞中ROS、SOD、MDA、LDH等相關(guān)指標(biāo)的影響。在AGEs作用下，隨著AGEs作用時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度隨之增加，呈現(xiàn)劑量與時(shí)間依賴性(如圖2A和2B)。細(xì)胞中的ROS水平在秦皮甲素作用30分鐘后出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)(圖2C)。隨著秦皮甲素作用濃度增加，ROS的水平呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)(圖2D)，相關(guān)酶的表達(dá)情況如圖3所示，可以得出經(jīng)AGEs處理過的細(xì)胞，其MDA，LDH，CHO，LDL，TG含量增加，SOD酶活性降低，與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)；而加入秦皮甲素后可提高SOD酶活力，降低MDA、LDH、CHO、LDL、TG含量，與AGEs模型組相比具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 秦皮甲素對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of esculin on oxidative stress related indicators 注：A：對(duì)SOD酶活性的影響；B：對(duì)MDA濃度的影響；C：對(duì)LDH濃度的影響；D：對(duì)CHO濃度的影響；E：對(duì)LDL濃度的影響；F：對(duì)TG濃度的影響。*代表與control組比較，P<0.05，#與AGEs模型組比較，P<0.05。Note:A:Effect of esculin on SOD enzyme activity.B:Effect of esculin on MDA concentration.C:Effect of esculin on LDH concentration.D:Effect of esculin on CHO concentration.E:Effect of esculin on LDL concentration.F:Effect of esculin on TG concentration.*Compared with the control group,P<0.05.# Compared with the AGEs model group,P<0.05.

2.3 AGEs 對(duì)血管粘附因子表達(dá)的影響

在AGEs 作用下VCAM-1和ICAM-1明顯增高，只加入秦皮甲素不會(huì)導(dǎo)致VCAM-1和ICAM-1的上升。在添加AGEs的培養(yǎng)基中加入秦皮甲素可以發(fā)現(xiàn)，VCAM-1和ICAM-1的含量下降，且VCAM-1隨秦皮甲素濃度增加下調(diào)趨勢(shì)明顯，而ICAM-1隨秦皮甲素加入降低效果不明顯，在15 mg/L秦皮甲素處理時(shí)ICAM-1含量高于AGEs組。表明秦皮甲素選擇性抑制內(nèi)皮粘附因子的表達(dá)。RT-qPCR檢測(cè)VCAM-1 mRNA和ICAM-1 mRNA的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在AGEs 作用下VCAM-1 mRNA和ICAM-1 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，表達(dá)量分別是對(duì)照組的5.9±0.2和4.4±0.7倍，在添加AGEs的培養(yǎng)基中加入秦皮甲素后可以發(fā)現(xiàn)，VCAM-1 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，25 mg/L秦皮甲素處理組的VCAM-1 mRNA表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的1.4±0.03倍，ICAM-1 mRNA隨秦皮甲素濃度增加降低效果不明顯。

2.4 秦皮甲素對(duì)細(xì)胞上清液中NO和ADMA的影響

AGEs(200 mg/L)處理內(nèi)皮細(xì)胞可顯著升高細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ADMA水平，同時(shí)下調(diào)NO水平。與AGEs(200 mg/L)處理組相比較，可以得到秦皮甲素(25 mg/L)處理組內(nèi)皮細(xì)胞的ADMA水平呈現(xiàn)明顯的下調(diào)，有顯著性統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；而秦皮甲素(25 mg/L)處理組內(nèi)皮細(xì)胞NO水平與AGEs(200 mg/L)處理組相比較則明顯的升高(P<0.05)。

3 結(jié)論

研究表明，在糖尿病并發(fā)癥以及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中，AGEs通過與其配體結(jié)合，通過多種細(xì)胞途徑，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷。在糖尿病并發(fā)癥過程中具有重要意義[10]。有不少研究顯示，天然植物中存在可抑制AGEs形成的活性物質(zhì)，如VB6[11]，粳稻的提取物[12]都可一定程度上削弱AGEs對(duì)血管，腎等器官的損傷，探索抑制AGEs的活性物質(zhì)在糖尿病并發(fā)癥的防治中有著重要的意義。

在本研究中，通過構(gòu)建AGEs培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞顯示，高濃度的AGEs可對(duì)ECV304細(xì)胞造成顯著的損傷。在50 mg/L濃度時(shí)，即可對(duì)細(xì)胞增殖造成影響。有研究顯示高濃度的AGEs可誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞凋亡，并與處理時(shí)間和濃度相關(guān)[8]。加入AGEs后，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS含量，MDA以及LDH含量隨即增加，提示在細(xì)胞水平存在損傷，與文獻(xiàn)相符[13]。在加入AGEs同時(shí)，給予不同濃度的秦皮甲素溶液處理，在一定濃度區(qū)間內(nèi)(15～25 mg/L)，細(xì)胞增殖率有顯著差別，同時(shí)，前幾項(xiàng)指標(biāo)出現(xiàn)顯著下降。降低了由AGEs引起的LDH，MDA增加，提示秦皮甲素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，且具有劑量依賴性。有研究顯示，秦皮甲素對(duì)DPPH等自由基有較強(qiáng)的清除能力[14]，可較好拮抗AGEs帶來的負(fù)面效應(yīng)。本研究進(jìn)一步證實(shí)，秦皮甲素可以抵抗由AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成，并與濃度有關(guān)。

圖4 秦皮甲素對(duì)血管粘附有關(guān)分子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of esculin on expression of vascular adhesion related molecules注：A：不同處理組ICAM-1蛋白的表達(dá)水平；B：不同處理組VCAM-1蛋白的表達(dá)水平；C：不同處理組ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平；D：不同處理組VCAM-1 mRNA的表達(dá)水平。*代表與control組比較，P<0.05，#代表與AGE-BSA組比較，P<0.05。Note:A:Expression levels of ICAM-1 protein in different treatment groups.B:Expression levels of VCAM-1 protein in different treatment groups.C:Expression levels of ICAM-1 mRNA in different treatment groups.D:Expression levels of VCAM-1 mRNA in different treatment groups.*Compared with the control group,P<0.05.# Compared with AGE-BSA group,P<0.05.

AGEs作用內(nèi)皮細(xì)胞后還可以增加LDL和HDL的糖基化，影響脂質(zhì)代謝[15 ]，在本次實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)脂代謝相關(guān)指標(biāo)CHO，LDL和TG顯示，加入秦皮甲素后顯著改善LDL和TG水平，但不同濃度間未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。可見，秦皮甲素在一定程度上可以改善由AGEs引起的脂質(zhì)代謝紊亂。

本次實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了細(xì)胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1水平。AGEs與RAGE結(jié)合后，可通過核因子kB(NF-kB)引起ICAM-1和VCAM-1表達(dá)水平的增高[16]，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖。加入秦皮甲素后可顯著抵抗由AGEs誘導(dǎo)的VCAM-1水平增加，而對(duì)ICAM-1改變并不明顯。在某種程度上抑制平滑肌增生。

內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的縮血管因子和舒血管因子之間的平衡是內(nèi)皮細(xì)胞功能正常的標(biāo)志。NO起舒張血管平滑肌，保持血管正常功能。ADMA做為L(zhǎng)-精氨酸類似物，與精氨酸競(jìng)爭(zhēng)性地抑制活性，達(dá)到減少NO生成，調(diào)節(jié)NO的生成起著重要作用[17]，ADMA濃度增加時(shí)，NO的生成減少。近年來大量的研究證實(shí)ADMA也可作為是內(nèi)皮功能不全的主要標(biāo)志之一[18]，也是心血管疾病以及糖尿病血管損傷的危險(xiǎn)因子。研究顯示[19]，體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中加入AGEs后，NO生成減少和eNOS蛋白表達(dá)下調(diào)，而ICAM-1的水平增加，本研究中發(fā)現(xiàn)，秦皮甲素加入后一定程度上抵抗由AGEs誘導(dǎo)的NO下調(diào)，同時(shí)可以減少ADMA的上調(diào)。

綜上，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)秦皮甲素可以從抑制氧化應(yīng)激，脂質(zhì)糖基化，抑制血管平滑肌增生，維持血管正常功能等方面保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受AGEs的損傷，通過降低ROS水平，增加抗氧化應(yīng)激酶SOD含量，NO的水平等抵抗由于AGE對(duì)血管帶來的負(fù)面影響?？梢钥紤]將秦皮甲素作為糖尿病并發(fā)癥防治的候選化合物進(jìn)行深入研究，從而達(dá)到控制AGEs的效應(yīng)，減少糖尿病患者血管的損傷的效果。