何 偉，李菁菁，包可翔，顏奕華，姜振錕，林 儉，陳善義，李易非

福建中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，廈門 361021

淀粉是煙草中一類重要的碳水化合物，新鮮煙葉通過調(diào)制，大部分淀粉經(jīng)酶解反應(yīng)降解為還原糖。但調(diào)制后的煙葉仍殘留少量淀粉，這對煙葉內(nèi)在質(zhì)量有不利的影響[1]。以淀粉形式存在的糖類在卷煙燃吸時會影響燃燒速率和完全性，并產(chǎn)生糊焦氣味，影響煙葉的香味和內(nèi)在品質(zhì)，因此淀粉含量的高低對烤煙煙葉的品質(zhì)有重要影響[2,3]。現(xiàn)有調(diào)制方法中淀粉降解轉(zhuǎn)化不夠充分，導致中國成品煙葉的淀粉含量普遍偏高，約為4%～6%，遠高于國外優(yōu)質(zhì)成品煙中的淀粉含量(約為 1%～2%)[4,5]?？竞鬅熑~淀粉殘留量過高已成為制約中國煙葉質(zhì)量提高的重要因素之一。

近年來，利用外加微生物或酶制劑降低煙葉中的淀粉含量、提高煙葉的可用性己成為煙葉原料研究的熱點之一。馮穎杰等[6]研究發(fā)現(xiàn)，向煙葉中施加高效產(chǎn)淀粉酶的蘇云金芽孢桿菌，煙葉中淀粉大幅度降低，煙葉的總糖、還原糖含量上升，有效提升了煙葉的整體質(zhì)量。沙云菲等[7]研究了淀粉酶復合酶制劑對上部煙葉的降解效果，處理后效果顯著。李曉等[8]采用α-淀粉酶、糖化酶分別處理烤煙和白肋煙，處理后煙葉品質(zhì)明顯改善。此外，這些生物技術(shù)在煙草中的應(yīng)用還必須考慮到微生物和酶制劑自身所帶來的污染、安全性和失活不穩(wěn)定等多種因素。

本實驗室前期從云南馬龍C3F-2014煙葉表面篩選出一株能夠高效表達淀粉酶的Bacilluskoreensis。本研究以該菌株為研究對象，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和金屬離子，提高了Bacilluskoreensis表達淀粉酶的產(chǎn)量，為煙草天然源淀粉酶處理煙葉，提高煙葉品質(zhì)的工業(yè)化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1Bacilluskoreensis，由云南馬龍C3F-2014片煙分離純化得到。

1.1.2 種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化鈉，pH=7.0。

1.1.3 初始發(fā)酵培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)：3 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L氯化鈉，pH=7.0。

1.2 試劑與儀器

試劑：胰蛋白胨等生物試劑，葡萄糖、淀粉、氯化鈉等分析純試劑，DNS等化學純試劑均購自于國藥集團化學試劑有限公司；牛肉浸膏購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母粉購自英國Oxoid公司。

主要儀器設(shè)備：SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CLC-B2V-M/CLC 222-TV型恒溫培養(yǎng)箱，MMM Group(德國)；1-14型離心機，SIGMA(德國)；DMG-9423A型烘箱，上海精宏；QS-2A型切絲機，鄭州嘉徳機電科技有限公司；Lambda 35型分光光度計，PerkinElmer(美國)；VX-95型滅菌鍋，Systec(德國)；Milli-Q Integral 5型純水機，Millipore(美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

1.3.1.1 平板活化

從甘油管中將菌種接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。

1.3.1.2 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)

從平板上挑取單菌落接種種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)6 h至培養(yǎng)基渾濁，溫度為37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm。

1.3.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)

按3%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)36 h，測定淀粉酶活。

1.3.2 淀粉酶活的測定

1.3.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

按表1配制不同濃度的葡萄糖溶液反應(yīng)體系，沸水浴反應(yīng)5 min，冷卻后加蒸餾水定容到25 ml。0號為空白，作為調(diào)零管。用可見光分光光度計在540 nm波長處測定吸光光度值。

表1 葡萄糖標準曲線配置表

1.3.2.2 粗酶液淀粉酶活的測定

將1 mL發(fā)酵液和1 mL 1%淀粉溶液混合并在 37 ℃水浴條件下保溫5 min(混合之前各自在37 ℃預(yù)熱5 min)。加入1.5 mL DNS試劑后在沸水浴5 min使酶失活，冷卻后用蒸餾水定容到25 mL?？瞻诪榘l(fā)酵液和淀粉溶液混合直接沸水浴，再加1.5 mL DNS，沸水浴5 min，冷卻后用蒸餾水定容到25 mL。用可見光分光光度計在540 nm波長處測定樣品吸光光度值。

1.3.2.3 淀粉酶活性定義及計算方法

淀粉酶活力單位定義(U/mL)：在37 ℃條件下，1 mL酶液每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖所用的酶量為1個酶活力單位。

淀粉酶酶活力根據(jù)以下公式進行計算：

淀粉酶酶活力(U/mL)=生成的葡萄糖毫克數(shù)×N×1 000/5

式中：N-稀釋倍數(shù)；1 000-轉(zhuǎn)化成 μg；5-反應(yīng)時間 5 min。

1.3.3 單因素試驗

分別對碳源、氮源、金屬離子、氯化鈉濃度、接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH進行優(yōu)化，測定每種因素對淀粉酶活的影響，選擇最佳培養(yǎng)基成分。

1.3.4 PB設(shè)計

PB設(shè)計用于考察8個獨立變量對響應(yīng)值也就是淀粉酶活的影響，從而挑選出影響顯著的因素。每個獨立變量有個兩個水平，分別表示為+1和-1，各因素的設(shè)計濃度見表2。

表2 PB設(shè)計培養(yǎng)基組分和水平

1.3.5 BBD響應(yīng)面設(shè)計

Box-Behnken設(shè)計適用于2～5個因素的優(yōu)化試驗?；赑B試驗設(shè)計和最陡爬坡試驗的試驗結(jié)果，采用3因素的Box-Behnken design(BBD)設(shè)計來分析各因素之間的關(guān)系并得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方。以PB設(shè)計篩選得到的對淀粉酶活影響顯著的因素作為設(shè)計因素，以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點，每個因素設(shè)有-1.68、-1、0、+1、+1.68五個水平(見表3)。

表3 BBD設(shè)計的因素水平

2 結(jié)果與分析

以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基對Bacilluskoreensis的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵所得到的淀粉酶活為565.13 U/mL。

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

碳源是構(gòu)成菌體的基本骨架，是菌體生長的能量來源，通過影響菌體的呼吸、能量供給、生長及相關(guān)代謝最終影響抗生素等次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[9]。選擇15 g/L的不同碳源進行碳源優(yōu)化試驗，結(jié)果如圖1所示，以淀粉作為碳源時酶活最高，其次是蔗糖和葡萄糖。因此，在下個階段的PB設(shè)計中，將淀粉作為考察因素。

2.1.2 氮源對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

氮源在合成菌體各種初級、次級代謝產(chǎn)物等含氮物質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要作用，同時在發(fā)酵生產(chǎn)中氮源起著調(diào)節(jié)菌體的生長及生物量的作用[10]。選擇20 g/L的不同氮源進行氮源優(yōu)化試驗，結(jié)果如圖2所示，菌株以蛋白胨作為氮源時酶活較高，其次是酵母粉培養(yǎng)基。因此，在下個階段的PB設(shè)計中，將蛋白胨和酵母粉含量作為考察因素。

圖1 不同碳源對淀粉酶活的影響Fig.1 The effect of different carbon sources on amylase activity注：1.淀粉，2.葡萄糖，3.乳糖，4.蔗糖，5.麥芽糖，6.對照(CK)。Note：1.Starch,2.Glucose,3.Lactose,4.Sucrose,5.Maltose,6.Contrast(CK).

圖2 不同氮源對淀粉酶活的影響Fig.2 The effect of different nitrogen sources on amylase activity注：1.蛋白胨，2.酵母粉，3.胰蛋白胨，4.牛肉膏，5.牛肉膏+蛋白胨，6.牛肉膏+胰蛋白胨。Note:1.Peptone,2.Yeast extract,3.Tryptone,4.Beef extract,5.Beef extract+Peptone,6.Beef extract+Tryptone.

2.1.3 金屬離子對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

金屬離子是微生物生命活動中必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì)，它們在機體中的生理功能主要是作為酶的活性中心的組成部分、維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等。不同金屬離子產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果見圖3，培養(yǎng)基中添加Ca2+、Fe2+對菌株產(chǎn)酶有促進作用，而添加Mg2+和Zn2+對菌株產(chǎn)酶有一定的抑制作用，尤其是Zn2+對Bacilluskoreensis產(chǎn)酶有顯著的抑制作用。Ca2+和Fe2+的濃度試驗表明，添加濃度為0.5 g/L的Ca2+和Fe2+時，菌株酶活最高。因此，在下個階段的PB設(shè)計中，將CaCl2和 FeSO4·7H2O作為考察因素。

2.1.4 不同鹽濃度對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

不同鹽濃度產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果見圖4，隨著培養(yǎng)基鹽濃度的增加，菌株產(chǎn)酶活力逐漸下降。當不添加鹽時，酶活最高，鹽濃度高于0.8%時，淀粉酶活顯著下降。因此，Bacilluskoreensis培養(yǎng)基選擇不添加 NaCl。

圖3 不同金屬離子對淀粉酶活的影響Fig.3 The effect of different metal ion on amylase activity

圖4 不同NaCl濃度對淀粉酶活的影響Fig.4 The effect of different concentrations of NaCl on amylase activity

2.1.5 不同接種量對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

由圖5可知，接種量對Bacilluskoreensis產(chǎn)酶影響較大。3%的接種量較之2%的接種量，酶活明顯提升，而5%和3%的接種量酶活基本持平，因此，選取3%的接種量為最佳接種量。

圖5 不同接種量對淀粉酶活的影響Fig.5 The effect of different inoculum size on amylase activity

2.1.6 不同初始pH對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

pH 值是衡量培養(yǎng)基酸堿度的一個重要指標，發(fā)酵過程中主要影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及代謝產(chǎn)物的分泌，從而影響酶活力，每一種微生物都有其生長發(fā)酵的適宜 pH 范圍。由圖6可知，pH 值從5.0到8.0酶活隨 pH 的增加而增加。pH 為 8.0 時，酶活達到最大值，繼續(xù)增加 pH 值，酶活迅速降低。從總的變化趨勢來看，中性偏堿性環(huán)境有利于菌株產(chǎn)酶。因此，確定8.0為菌株產(chǎn)酶最佳初始 pH 值。

圖6 不同初始pH對淀粉酶活的影響Fig.6 The effect of different initial pH on amylase activity

2.1.7 不同培養(yǎng)溫度對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

不同溫度產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果表明，溫度對產(chǎn)酶影響很大，溫度過低，微生物代謝緩慢，隨著溫度升高，代謝加快，由圖7可以看出37 ℃時酶活最高，之后隨著溫度的升高，酶活反而降低。因此，確定 37 ℃為產(chǎn)酶最適培養(yǎng)溫度。

圖7 不同溫度對淀粉酶活的影響Fig.7 The effect of different temperature on amylase activity

2.2 Plackett-Burman設(shè)計

通過單因素試驗表明，在Bacilluskoreensis產(chǎn)酶過程中，對其影響較大的8個變量為淀粉含量、蛋白胨含量、酵母粉含量、CaCl2含量、FeSO4·7H2O含量、NaCl含量、接種量和初始pH，再加上3個虛擬變量，每個變量有高(+)、低(-)2個水平[11]，采用Design-Expert軟件設(shè)計試驗，共12組試驗(表4)。使用Design-Expert軟件對表4進行分析，得到 PB設(shè)計方差分析結(jié)果。由表5可知，該模型的P值 =0.009 4，表明該模型顯著(P<0.05)。上述8個因素對淀粉酶活的影響排序為其中淀粉含量>蛋白胨含量>CaCl2含量>NaCl含量>接種量>初始pH>酵母粉含量>FeSO4·7H2O含量，且淀粉含量、蛋白胨含量和CaCl2含量為顯著因素。

表4 PB設(shè)計實驗結(jié)果

注：X1：淀粉含量；X2：蛋白胨含量；X3：虛擬因素1；X4：虛擬因素2；X5：酵母粉含量；X6：虛擬因素3；X7：CaCl2含量；X8：FeSO4·7H2O含量；X9：NaCl含量；X10：接種量；X11：初始pH。

Note:X1:starch;X2:peptone;X3:the virtual factors 1;X4:the virtual factors 2;X5:yeast extract;X6:the virtual factors 3;X7:CaCl2;X8:FeSO4·7H2O;X9:NaCl content;X10:inoculum size;X11:initial pH.

表5 PB設(shè)計各因數(shù)效應(yīng)分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note:*means significant difference atP<0.05,**means extremely significant difference atP<0.01,the same as below.

由上述 Plackett-Burman 試驗得到的回歸方程為：

淀粉酶活=261.03+15.58A+12.41B-0.13E+128.74G+1.33H+1.81J+3.95K-3.59L

其中A為淀粉含量，B為蛋白胨含量，E為酵母粉含量，G為CaCl2含量，H為FeSO4·7H2O含量，J為NaCl含量，K為接種量，L為初始pH。方程擬合的相關(guān)性為R2=98.71%，表明此多項式方程很好地模擬和解釋了 Plackett-Burman 的試驗結(jié)果。

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡法可以確定主要影響因素的水平，以其試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，能快速、經(jīng)濟地逼近最佳值區(qū)域[12]。最陡爬坡試驗結(jié)果見表6。由表6可知，淀粉含量為16 g/L，蛋白胨含量為22 g/L，CaCl2含量為0.6 g/L時，實驗組合4的響應(yīng)值(淀粉酶活)達到最高，此后淀粉酶活開始降低，這說明適當增加培養(yǎng)基中碳源、氮源以及金屬離子的含量有助于菌體的產(chǎn)酶，但過多的添加反而造成不利影響，因此選擇適宜的添加量尤為重要。選取實驗號4試驗組合中各種因素水平作為后續(xù)Box-Behnken試驗設(shè)計的中間點。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4 Box-Behnken中心組合設(shè)計

響應(yīng)面法可通過較少的試驗，較短的周期在整個區(qū)域內(nèi)給出因素與響應(yīng)值之間的明確函數(shù)關(guān)系，且精度更高，同時能夠研究幾種因素間的交互作用。根據(jù)最陡爬坡試驗篩選出的試驗中心點，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，利用Design Expert 10軟件進行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。建立以淀粉酶活為目標函數(shù)的二次回歸方程，并對所得到的回歸方程進行方差分析與顯著性檢驗，結(jié)果見表6。使用Design-Expert軟件進行分析，得到一個3元2次方程：

Y=-1 509.26+96.41A+83.43B+2 577.94C-0.38AB-28.58AC-3.68BC-1.96A2-1.73B2-1 885.86C2

方程中，A為淀粉含量，B為蛋白胨含量，C為CaCl2含量。方程中正號表示協(xié)同效應(yīng)，而負號表示拮抗效應(yīng)[13,14]。該方程的R2=0.916 3，表明模型能解釋91.63%淀粉酶產(chǎn)量的變化，回歸擬合程度較好。模型的ANOVA結(jié)果見表8。其中模型的P>F值=0.000 3，說明該模型是一個顯著并十分有效的模型。從ANOVA還可以看出淀粉和CaCl2在模型中是影響最為顯著的因素。

表7 BBD響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

表8 響應(yīng)面二次方程模型的ANOVA值

圖8分別表示了淀粉含量和蛋白胨含量、淀粉含量和CaCl2含量、蛋白胨含量和CaCl2含量的等高線圖和3D圖，各培養(yǎng)基成分的含量對應(yīng)的響應(yīng)值都是隨著培養(yǎng)基成分的含量的提高先升高后降低。根據(jù)上述分析和軟件的預(yù)測，Bacilluskoreensis的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為淀粉含量18.74 g/L，蛋白胨含量21.56 g/L，CaCl2含量0.52 g/L，預(yù)測的最高酶活為964.31 U/mL。為驗證模型預(yù)測的可靠性，用預(yù)測的最優(yōu)培養(yǎng)基條件下進行3次平行試驗，得出酶活的實際平均值為959.39±22.34，與響應(yīng)面擬合所得的方程預(yù)測值符合良好，說明該模型可以很好的模擬Bacilluskoreensis的產(chǎn)酶效率。

3 結(jié)論

生物酶法降解淀粉因為條件溫和、易于操作、改善效果明顯，在實際應(yīng)用中具有一定優(yōu)勢，可將淀粉分解成低聚糖、半乳糖醛酸、還原糖等，減少煙草原料的刺激性和雜氣，改善吸食品質(zhì)，提高其在煙草行業(yè)中的使用價值[15]。生物酶法所使用的酶主要有商品酶和菌株發(fā)酵提取的酶，產(chǎn)淀粉菌株主要有解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、米根霉等[16]，這些高效的菌株大多不是從煙葉表面分離得到。本研究從全國多個產(chǎn)地片煙篩選得到的Bacilluskoreensis來源于煙葉表面，與煙草的煙香能較好的契合，對可溶性淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉都有較強的降解能力，能有效協(xié)調(diào)煙草的化學成分、減少刺激、增加煙香，有很廣泛的應(yīng)用前景。

本研究通過單因素試驗、PB設(shè)計、最陡爬坡試驗和BBD響應(yīng)面設(shè)計對Bacilluskoreensis的培養(yǎng)基進行了系統(tǒng)的優(yōu)化。BBD響應(yīng)面設(shè)計較之傳統(tǒng)的線性回歸和正交試驗有周期短、試驗次數(shù)少、精度高等優(yōu)勢，因此在微生物發(fā)酵中得到廣泛的應(yīng)用[17]。該方法先通過PB設(shè)計選出影響酶活的最顯著因素為淀粉、蛋白胨和CaCl2，再通過最陡爬坡設(shè)計試驗逼近響應(yīng)面的中心點，最后通過BBD響應(yīng)面設(shè)計得出最優(yōu)的培養(yǎng)基配方。驗證試驗得出酶活的實際平均值為959.39±22.34 U/mL，較之初始酶活提高了69.67%，大幅度提高了淀粉酶活和片煙處理效率，為進一步微生物酶制劑的工業(yè)化應(yīng)用提供了材料基礎(chǔ)。故下一步研究將在本研究的基礎(chǔ)上，研究Bacilluskoreensis的發(fā)酵罐條件(溶氧、轉(zhuǎn)速、pH調(diào)節(jié)等)和該淀粉酶的酶學性質(zhì)、分子量等，并通過硅藻土過濾、膜過濾等方法進一步精制酶液。本研究開發(fā)的酶制劑天然高效、感官評吸配伍性強，為卷煙生產(chǎn)企業(yè)提高上部葉的可用性和提高煙草品質(zhì)提供一條新的方向并奠定了良好的基礎(chǔ)。