汪茜 包涵 張金蓮 宋娟 劉增亮 黃京華 陳廷速

摘 ?要 ?研究盆栽條件下，接種不同叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi， AMF）種類對生姜不同生育時(shí)期農(nóng)藝性狀的影響及其在生姜根內(nèi)的定殖情況。采用生姜組培苗，于幼苗期分別接種12株AMF進(jìn)行生姜農(nóng)藝性狀比較試驗(yàn)，在溫室盆栽接種后每隔30 d對生姜根系進(jìn)行取樣分析，比較菌根侵染率、侵染強(qiáng)度和叢枝豐度的大小，以觀察不同AMF菌株對生姜苗的侵染動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，所有接種AMF組的生姜植株，其生長量均高于空白對照組。結(jié)合不同菌株在根系的侵染率，篩選出生姜AMF優(yōu)勢種類為：細(xì)凹無梗囊霉（Acaulospora scrobiculata）、網(wǎng)狀球囊霉（Glomus reticulatum）、隱形球囊霉（Paraglomus occltum）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）。說明苗期接種這4個(gè)優(yōu)勢菌種，能夠促進(jìn)生姜生長，是適宜生姜生長的優(yōu)良AMF菌株。

關(guān)鍵詞 ?生姜;叢枝菌根真菌;農(nóng)藝性狀;侵染率;優(yōu)勢菌株

中圖分類號(hào) ?Q945.12 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?An experiment was conducted to analyze the effects of arbuscular mycorrhizal （AM） fungi on the growth of ginger （Zingiber officinale Roscoe） under greenhouse conditions. Ginger plantlets were inoculated with 12 different AM species， and the agronomic characters， the rate of colonization， infection intensity and arbuscular abundance were analyzed in every 30 days after inoculation. The results showed the ginger plantlets inoculated with AM fungi grew better than the ones without AM fungi. The dominant strains of AM fungi were Acaulospora scrobiculata， Glomus reticulatum， Paraglomus occltum and Glomus mosseae according to the growth simulation and infection in roots. It suggests that the inoculation of the four dominant strains improved the growth， yield and quality， and further research is needed to develop dominant strains.

Keywords ?ginger （Zingiber officinale Roscoe）; arbuscular mycorrhizal fungi; agronomic characters; infection rate; dominant strains

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.004

AMF是一類在生物防治土傳病害和提高植物抗/耐病性方面極具應(yīng)用潛力的微生物資源。叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza， AM）是由球囊霉門（Glomeromycota）真菌與植物根系形成的互惠共生體，90?%以上的陸地植物都能形成叢枝菌根，是自然界中最普遍的一種菌根類型。AMF與植物根系共生后，能夠影響土壤理化性質(zhì)和根圍微生物區(qū)系，并通過菌根幫助宿主植物獲取根際的碳、氮養(yǎng)分和水分，從而促進(jìn)植物的生長，提高植物的耐旱和抗逆能力[1-3]。AMF在植物根際形成的龐大菌絲網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，對穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)、控制水土流失、增強(qiáng)對土傳病害的抑制、保持植物根際土壤生態(tài)系統(tǒng)良性發(fā)展有重要意義[4-7]。已有研究表明，叢枝菌根真菌能降低真菌、線蟲、細(xì)菌等病原體對黃瓜（Cucumis sativus）、草莓（Fragaria ananassa）、西紅柿（Lycopersicon esculentum）、柑橘（Citrus reticulata）、油橄欖（Olea europaea）、截形苜蓿（Medicago truncatula）、香瓜（Cucumis melo）、玉米（Zea mays）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、香蕉（Musanana?lour）等植物的危害程度，減少農(nóng)藥使用量[8-10]。目前已經(jīng)證實(shí)的可有效控制植物土傳病害的AMF超過30種[11]。

生姜種植過程中由于土壤青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）導(dǎo)致的姜瘟?。℅inger Wilt）的危害，嚴(yán)重影響生姜的產(chǎn)量和品質(zhì)[12]。但是化學(xué)防治效果不理想，且會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病原菌抗藥性等負(fù)面影響[13];而生物防治作為綜合防治姜瘟病的措施之一，對生態(tài)平衡和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有特別重要的意義，一直是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。

當(dāng)前，生姜叢枝菌根真菌的研究相關(guān)文獻(xiàn)相對較少。有研究表明，AMF對生姜某些生理指標(biāo)具有一定影響。AMF明顯增加生姜的株高、根莖產(chǎn)量、分枝數(shù)等，并能提高生姜葉片和根中N、P、K 等元素的含量，提高單葉凈光合速率[14]。接種AMF可以有效降低姜瘟病的病情指數(shù)，對姜瘟病起到抑制作用[15]。本文通過篩選出對生姜生長有益的優(yōu)勢AMF種類，探討其對生姜生長的促進(jìn)作用，對減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥的使用量，改善土壤生態(tài)，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

生姜組織培養(yǎng)種苗（品種來自廣西柳州市柳江縣當(dāng)?shù)胤N植品種）。

花盆（盆口直徑為15 cm、深度為12.5 cm、花盆用酒精擦拭一遍再用）、營養(yǎng)液（Hogland）、基質(zhì)（塘泥∶沙=1∶1）。

AMF菌株由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所土壤微生物課題組采樣分離保藏，具體菌株及編號(hào)如表1所示。

生姜根系采集材料：剪刀、封口袋、50%酒精等。

生姜根系染色材料：氫氧化鉀（廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心）、30%過氧化氫（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、氨水（廉江市愛廉化試劑有限公司）、冰乙酸（成都市科龍化工試劑廠）、墨水（派克）、50 mL離心管、濾網(wǎng)、鑷子、移液槍等。

供試菌株（表1）統(tǒng)一擴(kuò)繁均為含有侵染根段、菌絲、孢子和培養(yǎng)基質(zhì)混合物，作為AMF接種體菌劑。孢子密度均多于10個(gè)/g，接入量為30 g/盆。

試驗(yàn)于2017年6月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所溫室進(jìn)行。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì) ?選取生長健壯、大小一致的生姜組織培養(yǎng)種苗78株，用多菌靈沖洗消毒。將消毒后的生姜種苗移栽至洗凈晾干的花盆中，每盆移栽兩株生姜苗，并接入30 g/盆AMF菌劑。具體操作如下：花盆內(nèi)底部墊上和其底部大小一致的圓形塑料紙后，放入約1/3已滅菌的基質(zhì);移栽2株生姜種苗，并在其根系附近放入提前準(zhǔn)備好的AMF菌劑，且須保證根系與AMF菌劑相接觸;繼續(xù)往花盆倒入已滅菌的基質(zhì)至花盆3/4，保證基質(zhì)沒過生姜根系、莖塊;每盆按菌劑編號(hào)貼好標(biāo)簽。同時(shí)設(shè)置不接種的空白對照（用于擴(kuò)繁AMF的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)30 g/盆），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共39盆。

將盆栽放置于25?℃恒溫玻璃溫室內(nèi)，定期觀察，每隔1?d適量澆水，每周澆一次營養(yǎng)液。

1.2.2 ?生姜根系的采集 ?生姜栽種90 d后，進(jìn)行生姜根系采集，采集方法如下：用剪刀剪下約1/3根系，用于觀察AMF侵染情況，分別記錄根內(nèi)菌絲、根外菌絲、泡囊的數(shù)量，計(jì)算侵染率，對比不同AMF侵染根系的能力。采集根系樣品時(shí)盡量采集老、嫩、粗、細(xì)各級(jí)根段，使樣品更具代表性。根系樣品用自來水清洗干凈根系上附著的基質(zhì)后用去離子水清洗數(shù)次，隨后將其浸泡于50%酒精中保存，并寫上編號(hào)。

1.2.3 ?根系染色處理及侵染率測定 ?生姜根系的染色主要參考汪茜等[16]的方法，菌根侵染率的測定參考王幼珊等[17]的方法。

1.2.4 ?測定項(xiàng)目與方法 ?接種后每隔30 d取樣1次，共3次。每次每處理取3株幼苗，每株幼苗隨機(jī)選取鮮根30條，剪成1 cm根段，取一定樣品，用墨水醋染色[16]、網(wǎng)格交叉法[17]測定根系侵染率。

全生育期3次采樣，依次為：幼苗期，發(fā)根期，塊莖膨大期。每次每處理取3株幼苗。農(nóng)藝性狀測定有效葉數(shù)、葉長、葉寬和株高。

生姜收獲期將生姜地上部用自來水沖洗后再用去離子水洗凈，于105?℃殺菌30 min后再置70?℃烘干、稱重;株高及莖粗采用直接測量法。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件和DPS統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，置信水平為95%（P<0.05）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?接種不同AMF菌株的生姜根系侵染情況

不同AMF菌株對生姜根系侵染情況如表2所示。GZ-10根外菌絲侵染率最高，其侵染率平均值為31%，其次為GZ-1，其根外菌絲侵染率的平均值為22.5%，再次為LC39-10，其根外菌絲平均侵染率為22%。根內(nèi)菌絲侵染率排名前三的為GZ-10、GZ-1、LC39-10，其中，GZ-10根內(nèi)菌絲侵染率平均值為49%，GZ-1根內(nèi)菌絲侵染率平均值為35%，LC39-10根內(nèi)菌絲侵染率平均值為29%。泡囊侵染率相對較高的為LC58，其泡囊平均侵染率為2.5%，其次為FS-1-74，其泡囊的平均侵染率為1%。FC-1-2、YN-2-7、GZ-10、LC39-10、E26-46中均未出現(xiàn)泡囊結(jié)構(gòu)。如表2所示，對照組CK均未觀察到根外菌絲、根內(nèi)菌絲和泡囊結(jié)構(gòu)。根內(nèi)菌絲、根外菌絲、泡囊結(jié)構(gòu)及CK根段的染色圖像如圖1所示。

2.2 ?不同AMF菌株對生姜幼苗生長的影響

3 ?討論

AMF在自然界中廣泛分布，同一種AMF可以和不同的宿主植物形成共生關(guān)系，同一種植物根系也可以和多種不同的AMF形成共生關(guān)系[18]。不同的AMF對同一種植物所表現(xiàn)的效果不同，宿主植物和AMF之間存在相互選擇性[19]。AMF和宿主植物相互選擇后，對宿主植物的生長發(fā)育產(chǎn)生促進(jìn)作用的AMF，可以作為該植物的優(yōu)勢種[20]。本試驗(yàn)中，細(xì)凹無梗囊霉（Acaulospora scrobiculata）， 網(wǎng)狀球囊霉（Glomus reticulatum）， 隱形球囊霉（Paraglomus occltum）3種AMF均有效的促進(jìn)了生姜的生長，可以選為生姜生長的優(yōu)勢種。另一方面，由于AMF對宿主植物具有一定的選擇性，同一種宿主植物，不同的AMF的侵染率會(huì)有所不同，其原因可能是宿主植物和不同的AMF的親和性有所不同，相對較高侵染率的AMF，說明其和宿主植物的親和性相對較強(qiáng)[21]。試驗(yàn)中，對比12種不同AMF在生姜根系的侵染率，摩西球囊霉（Glomus mosseae）的侵染率最高，說明該AMF和生姜根系的親和度較高，兩者能更有效的互相識(shí)別，故該菌株也可以作為優(yōu)勢菌株。

研究結(jié)果表明，所有12個(gè)菌株均能侵染生姜根系，而對照組的株高最為矮小、莖塊質(zhì)量最輕，且染色后沒有檢測到菌根特有結(jié)構(gòu)。說明施用AMF后對生姜的促生起到一定作用。其中，促生作用較為明顯的優(yōu)勢菌株為細(xì)凹無梗囊霉（Acaulospora scrobiculata）， 網(wǎng)狀球囊霉（Glomus reticulatum）和隱形球囊霉（Paraglomus occltum），在生姜根系的定殖率試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其侵染率雖不是12種菌劑中最高，但均排在前列。而摩西球囊霉（Glomus mosseae）的供試菌株對生姜根系的侵染率最高，但其株高、莖塊重等生長量并不是最優(yōu)，說明該菌株雖然具有高侵染率，但其對生姜體現(xiàn)的并不是促生作用。有研究表明，AMF與宿主植物形成共生后，通過改變宿主植物根系結(jié)構(gòu)，與病原微生物競爭獲取所需的營養(yǎng)、誘導(dǎo)宿主植物抗病防御體系的形成等方式來實(shí)現(xiàn)抗病[22]。目前，還不能判斷AMF對植物的促生和抗病能力能百分之百同時(shí)體現(xiàn)，而摩西球囊霉（Glomus mosseae）菌株與生姜在具有高親和性的前提下，可在土壤中形成大量菌絲網(wǎng)，有可能在提高生姜的抗病能力方面發(fā)揮一定的作用，故選其作為優(yōu)勢種，其抗病性的效果還需要在今后做進(jìn)一步的研究。且生姜根系很不發(fā)達(dá)，根毛退化嚴(yán)重，對菌根的依賴性較高。因此，應(yīng)加強(qiáng)在大田條件下對生姜菌根的研究，并且使菌根生物肥料能夠應(yīng)用于生姜生產(chǎn)。

4 ?結(jié)論

接種AMF后，生姜株高、葉片數(shù)、地上部分干重、地上部分濕重、莖塊重均優(yōu)于未接種AMF的對照組。對比不同AMF對生姜的促生效果，細(xì)凹無梗囊霉（Acaulospora scrobiculata），網(wǎng)狀球囊霉（Glomus reticulatum），隱形球囊霉（Paraglomus occltum）可選為優(yōu)勢AMF。對比不同AMF菌劑侵染生姜根系的侵染率，摩西球囊霉（Glomus mosseae）可選為優(yōu)勢種。

參考文獻(xiàn)

李元敬， 劉智蕾， 何興元， 等. 叢枝菌根共生體中碳、氮代謝及其相互關(guān)系[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2014， 25（3）： 903-910.

Hiiesalu I， Partel M， Davison J， et al. Species richness of arbuscular mycorrhizal fungi： Associations with grassland plant richness and biomass[J]. New Phytologist， 2014， 203： 233-244.

Liu L L， Liu R D， Huang R H. Effect of arbuscular mycorrhizal fungi （AMF） on accumulation capability for Se and photosynthesis characteristics of Actinidia chinensis ‘Hongyang leaves[J]. Science & Technology of Food Industry， 2014， 10： 234-242.

王 ?瑾， 畢銀麗， 張延旭， 等. 接種叢枝菌根對礦區(qū)擾動(dòng)土壤微生物群落及酶活性的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 45（8）： 1417-1423.

Erik V， Wilfred F M R， Hannes A G， et al. Positive effects of organic farming on below-ground mutualists： large-scale comparison of mycorrhizal fungal communities in agricultural soils[J]. New Phytologist， 2010， 186（4）： 968-979.

Sikes B A， Cottenie C， Klironomos J N. Plant and fungal identity determines pathogen protection of plant roots by arbuscular mycorrhizas[J]. Journal of Ecology， 2009， 97： 1274-1280.

Borowicz V. Do arbuscular mycorrhizal fungi alter plant-pathogen relations[J]. Ecology， 2001， 82： 3057-3068.

Garg N， Chandel S. Arbuscular mycorrhizal networks： process and functions. A review[J].Agronomy for Sustainable Development， 2010， 30（3）： 581-599.

Artursson V， Finlay R D， Jansson J K. Interactions between arbuscular mycorrhizal fungi and bacteria and their potential for stimulating plant growth[J]. Environmental Microbiology， 2006， 8（1）： 1-10.

曾維愛， 龍世平， 李宏光， 等. 苗期接種不同叢枝菌根真菌對煙草青枯病防治效果的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 42（6）： 612-615.

李海燕， 劉潤進(jìn)， 束懷瑞. 叢枝菌根真菌提高植物抗病性的作用機(jī)制[J]. 菌物系統(tǒng)， 2001， 20（3）： 435-439.

Yang W， Xu Q， Liu H X， et al. Evaluation of biological control agents against Ralstonia wilt on ginger[J]. Biological Control， 2012， 62： 144-151.

陳婧怡. 姜瘟病病原拮抗菌的篩選與鑒定[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

王維華， 李 ?敏， 劉潤進(jìn)， 等. AMF對生姜某些生理指標(biāo)的影響[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2003， 20（3）： 175-177.

劉貴猛， 譚樹朋， 孫文獻(xiàn)， 等. AMF和PGPR對生姜青枯病的影響[J]. 菌物研究， 2017， 15（1）： 1-7.

汪 ?茜， 張金蓮， 龍艷艷， 等. 廣西柳江生姜根際土壤叢枝菌根真菌資源研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 29（1）： 115-119.

王幼珊， 張淑彬， 張美慶. 中國叢枝菌根真菌資源與種質(zhì)資源[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2011.

Millerwideman M A， Watrud L S. Sporulation of Gigaspora margarita on root cultures of tomato[J]. Canadian Journal of Microbiology，1984， 30（5）： 642-646.

龍宣杞. 叢枝菌根真菌（AMF）高效菌種的選育[D]. 天津： 天津大學(xué)， 2009.

王 ?穎. 甘草植物根際AMF多樣性及其生長效應(yīng)的研究[D]. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古大學(xué)， 2008.

齊國輝， 陳貴林， 呂桂云， 等. 叢枝菌根真菌對重茬草莓產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2001， 18（6）： 341-344.

王倡憲， 李曉林， 宋福強(qiáng)， 等. 兩種叢枝菌根真菌對黃瓜苗期枯萎病的防效及根系抗病相關(guān)酶活性的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 20（1）： 53-57.