楊文健，焦蓉，劉月，孫曉東，桑明

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院兒科，襄陽(yáng) 441000)

膿毒癥是由多種炎癥因子過(guò)量產(chǎn)生并介導(dǎo)的全身性炎癥反應(yīng)的一類(lèi)疾病[1]。嚴(yán)重的膿毒癥與感染性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)密切相關(guān)，更重要的是，心臟功能受損最為常見(jiàn)[1]。然而，膿毒癥病理生理學(xué)尚不完全清楚，治療方法有限。目前已知炎癥反應(yīng)參與膿毒癥心功能障礙的發(fā)生發(fā)展[2-3]。因此，找到有效的治療干預(yù)措施以抑制炎癥信號(hào)傳導(dǎo)，從而中斷細(xì)胞因子合成的惡性循環(huán)，可以最終抑制病情惡化。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分，可在被細(xì)菌感染的宿主中引起局部或全身炎癥反應(yīng)。Toll樣受體-4(Toll like receptor-4，TLR-4)是一種LPS受體，可以識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式，對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有著至關(guān)重要的作用[4]。雖然心肌細(xì)胞不是參與先天免疫的特異性細(xì)胞，但TLR-4可在心肌細(xì)胞中表達(dá)。TLRs在膿毒癥介導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮重要作用，但是其機(jī)制尚不清楚。據(jù)報(bào)道，激活TLR-4導(dǎo)致MyD88(myeloid differentiation primary-response gene 88)募集，隨后激活下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)途徑[4]。MAPKs途徑的激活誘導(dǎo)促炎基因表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)多器官功能障礙和SIRS的進(jìn)展。因此，在心血管疾病中，MAPK信號(hào)通路可能是一個(gè)新的治療方向。

3,3′-二吲哚基甲烷(3，3′-diindolylmethane，DIM)，屬于吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol，I3C)的衍生產(chǎn)物，可從十字花科植物中提取，已證實(shí)具有抗血管生成、抗癌和抗肥大等作用[5-7]。此外，吲哚化合物在某些炎癥性疾病中具有抗炎作用[7]。然而，關(guān)于DIM對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的炎性損傷的作用知之甚少。因此，在本研究中，筆者首先觀察DIM是否具有抑制LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，并進(jìn)一步探討了DIM對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO公司)，四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：18040502)，CCK-8試劑盒(Dojindo，Kumamoto，Japan)，TRIzol試劑(Invitrogen，11667-165)，LPS(Sigma，L2630)。一抗包括ERK1/2(Cell Signaling Technology，4370)，p-ERK1/2(Cell Signaling Technology，4695)，P38(Cell Signaling Technology，9212)，p-P38(Cell Signaling Technology，4511)，T-JNK(Cell Signaling Technology，9258)，p-JNK(Cell Signaling Technology，4668)，TLR-4(Santa Cru Biotechnology，30002)和GAPDH(Santa Cru Biotechnology，25778)。二抗來(lái)自LI-COR Biosciences的山羊抗兔抗體(Lincoln，NE，USA)。DIM(通過(guò)高效液相色譜法分析測(cè)定含量為98%)購(gòu)自上海醫(yī)療科技發(fā)展有限公司。

1.2設(shè)備 低溫離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5804 德國(guó))，電泳轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-RAD，美國(guó))；數(shù)顯恒溫水浴鍋(泰州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)，Model 550 酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))；Bio Sen SC300 凝膠圖象分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)；Heal Force 生物安全柜(力康生物公司)；倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司)，共聚焦顯微鏡(LEICA，SP5)，Smartspec Plus分光光度計(jì)(Bio-Rad)，ABI 7500儀器(Life Technologies，USA)。

1.3心肌細(xì)胞的分離和分組 新生大鼠心肌細(xì)胞獲自出生3 d內(nèi)的SD大鼠[8]。吸入二氧化碳(CO2)法處死新生大鼠。首先，將心臟置于冷DMEM/F12的直徑100 mm培養(yǎng)皿中，剪碎組織。心臟組織在于34 ℃、0.125%tryspin中消化15 min，輕輕搖動(dòng)，重復(fù)消化5次，獲得單個(gè)細(xì)胞。收集所有消化液并以1000 r·min-1(r=42 cm)離心8 min。將這些細(xì)胞重新懸浮并通過(guò)直徑75 μm細(xì)胞過(guò)濾器濾過(guò)。最后將分離的細(xì)胞用含有15%FBS、1%青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(100 mg·mL-1)的DMEM/F1培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、LPS組、DIM組和LPS+DIM組。細(xì)胞饑餓處理8 h后，再給予LPS和(或)DIM。

1.4CCK-8 通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DIM對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響。細(xì)胞(1×105·mL-1)接種在96孔中并培養(yǎng)48 h，每個(gè)濃度6個(gè)副孔。細(xì)胞饑餓處理8 h后，給予不同濃度的DIM(5，10，20和60 μmol·L-1)處理24 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL孵育4 h，并用酶標(biāo)儀(Bio-Tek，Synergy HT)在450 nm(吸收波長(zhǎng))和630 nm(參比波長(zhǎng))檢測(cè)吸光度。

1.5免疫熒光染色 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)標(biāo)記α-肌動(dòng)蛋白染色心肌細(xì)胞來(lái)觀察大鼠新生心肌細(xì)胞的形態(tài)。用溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，4%多聚甲醛(Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd)固定15 min，0.2%Triton X-100(Amresco)透化后，用8%山羊血清封閉。然后用1%抗-α-肌動(dòng)蛋白抗體(Millipore)1：100的稀釋液孵育過(guò)夜，再與山羊抗小鼠IgG二抗(Alexa Fluor 488)共孵育1 h，用含有DAPI的Slow Fade Gold抗褪色試劑固定在載玻片上。用定量數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(Image Pro-Plus，6.0版)測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。

1.6實(shí)時(shí)-熒光定量聚合酶鏈免疫反應(yīng)(RT-PCR)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)促炎遞質(zhì)的mRNA表達(dá)水平。向各組大鼠心肌細(xì)胞中加入適當(dāng)體積的TRIzol，提取RNA。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，并使用Smartspec Plus分光光度計(jì)(Bio-Rad)使用A260/A280估算純度。使用oligo(dT)引物和Tran-scrptor First Strand cDNA合成試劑盒(Takara，047A)在20 μL反應(yīng)體積中用96孔熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)將RNA(每個(gè)樣品2 μg)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix(Takara，04897030001)用ABI 7500儀器(Life Technologies，USA)定量PCR擴(kuò)增，并檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α和HMGB1相對(duì)mRNA表達(dá)水平。以下是PCR引物：IL-6正義鏈：5'-GTTGCCTTCT TGGGACTGATG-3'，反義鏈：5'-ATACTGGTCTGTTGTG GGTGGT-3';TNF-α正義鏈：5'-AGCATGATCCGAGTG-TGGAA-3'，反義鏈：5'-TAGACAGAAGAGCGTGGTGGC-3';HMGB1正義鏈：5'-TGCT GCATATCGAGC-TAAAGG-3'和反義鏈：5'-CCATACTGTACC AGG-CAAGGT-3';GAPDH：正義鏈：5'-GACATGCC-GCCTGGAGAA AC-3'，反義鏈：5'-AGCCCAGG-ATGCCCTTTAGT-3'。反應(yīng)在95 ℃下進(jìn)行30 s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在95 ℃下10 s，在60 ℃下34 s。

1.7Western blotting法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 利用蛋白質(zhì)印跡評(píng)估TLR-4、P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK等相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。向各組新生大鼠心肌細(xì)胞加入蛋白裂解液，提取蛋白質(zhì)，并用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑(Thermo，23225)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。在還原條件下，在10%SDS/PAGE上分離凝膠中的蛋白質(zhì)樣品(30 μg)，然后使用凝膠轉(zhuǎn)移裝置(invitrogen)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。為了避免非特異性抗體結(jié)合的干擾，在室溫下用5%脫脂乳將PVDF膜封閉1.5 h。PVDF膜與TLR-4、P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK及GAPDH的一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，TBS洗脫后敷二抗。洗脫后采用電化學(xué)發(fā)光顯色，再進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1DIM對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞活性的影響 利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度DIM(5，10，20和60 μmol·L-1)對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞活性的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1。5，10，20 μmol·L-1DIM對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞沒(méi)有顯著的細(xì)胞毒性。然而，與對(duì)照組比較，大劑量DIM(60 μmol·L-1)作用的細(xì)胞活性顯著降低。提示60 μmol·L-1DIM對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性。為了減少DIM的非特異性細(xì)胞毒性，觀察了DIM對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷的影響。用LPS(10 mg·L-1)和不同濃度(5，10，20和60 μmol·L-1)的DIM共同與心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h。結(jié)果見(jiàn)圖1。LPS+DIM組(LPS+DIM 5，10，20 μmol·L-1)細(xì)胞活性高于LPS組。60 μmol·L-1DIM 組細(xì)胞存活率明顯降低。綜上，DIM作用濃度以20 μmol·L-1為宜。

2.2DIM對(duì)LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響 利用免疫熒光顯微鏡觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，鑒別DIM對(duì)LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響。將心肌細(xì)胞與LPS(10 mg·L-1)和(或)DIM(20 μmol·L-1)共孵育24 h。對(duì)照組可觀察到正常心肌細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則扁平狀，逐漸形成不規(guī)則星狀，利于與其他細(xì)胞形成交織。經(jīng)LPS處理后，心肌細(xì)胞體積變大，肌絲紊亂。經(jīng)過(guò)DIM治療后，LPS誘導(dǎo)的肌絲損傷得到改善。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明DIM可以改善LPS誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)變化，見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01。圖1 各組新生大鼠心肌細(xì)胞活性比較Compared with control group，*1P<0.05，*2P<0.01.Fig.1 Comparison of cell viability of cultured neonatal rat cardiomyocytes in all groups

2.3DIM顯著降低炎癥因子的mRNA水平 IL-6、TNF-α與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[9-10]。研究證實(shí)，晚期促炎因子HMGB1亦與膿毒癥臨床結(jié)果密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)干擾HMGB1表達(dá)相對(duì)于干擾IL-6和TNF-α更有效。因此，檢測(cè)早期和晚期炎癥因子的mRNA表達(dá)水平，以觀察LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞的炎癥損傷程度。見(jiàn)圖3，12 h后，LPS組早期促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平明顯增加。而LPS+DIM組IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯低于LPS組。此外，與12 h比較，24 h細(xì)胞內(nèi)IL-6、TNF-α的表達(dá)水平明顯降低，而HMGB1的表達(dá)水平顯著增加。LPS+DIM組可降低晚期炎癥細(xì)胞因子HMGB1的基因水平。另外，與對(duì)照組比較，DIM組新生大鼠心肌細(xì)胞mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組新生大鼠心肌細(xì)胞的體外形態(tài)學(xué)變化(×200)Fig.2 In vitro morphological changes of cultured neonatal rat cardiomyocytes in all groups(×200)

2.4DIM通過(guò)TLR-4/MAPKs途徑發(fā)揮作用 TLR-4參與LPS激活的炎癥信號(hào)通路傳導(dǎo)[3]。研究表明，TLR-4可以激活下游MAPK通路，MAPK是驅(qū)動(dòng)膿毒癥期間炎癥因子產(chǎn)生的關(guān)鍵遞質(zhì)[11-12]。MAPK由ERK1/2、P38和JNK組成。因此，在本研究中，探究TLR-4/MAPKs途徑是否參與DIM對(duì)LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞炎癥損傷保護(hù)作用。利用Western blotting檢測(cè)TLR-4、ERK1/2、P38和JNK相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。如圖4所示，膿毒癥組細(xì)胞TLR-4、p-ERK1/2、p-P38和p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯升高。與LPS組比較，LPS+DIM組上述蛋白表達(dá)明顯減少。此外，對(duì)照組和DIM組之間的TLR-4、p-ERK1/2、p-P38和p-JNK水平?jīng)]有顯著差異。

3 討論

強(qiáng)大的炎癥反應(yīng)被視為膿毒癥重要的病理生理過(guò)程。LPS可與心肌細(xì)胞表面TLRs受體結(jié)合，激活體內(nèi)NF-κB信號(hào)通路，促使炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，均可直接或間接抑制心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙；另一方面，炎癥因子進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路激活，形成惡性循環(huán)，引發(fā)炎癥“風(fēng)暴”，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致多器官功能障礙甚至死亡[13-14]。LPS可導(dǎo)致早期促炎細(xì)胞因子的過(guò)量產(chǎn)生，包括IL-6和TNF-α[13]。IL-6被認(rèn)為是膿毒癥和膿毒性休克的重要標(biāo)志物，可預(yù)測(cè)疾病的發(fā)展及其嚴(yán)重程度。由心肌細(xì)胞分泌的TNF-α可誘導(dǎo)多種補(bǔ)體因子、一氧化氮合酶、細(xì)胞黏附分子、血小板活化因子和多種白細(xì)胞介素的產(chǎn)生，與心肌細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，啟動(dòng)心肌線粒體凋亡通路，在發(fā)病早期中起關(guān)鍵作用[1，15-16]。早期促炎癥因子(TNF-α和IL-1β)在早期收縮功能下降中起關(guān)鍵作用，但不能解釋膿毒癥的長(zhǎng)期心肌功能障礙的原因[13]。膿毒癥的臨床結(jié)果與晚期HMGB1遞質(zhì)的水平變化密切相關(guān)，而不是LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6等早期炎癥遞質(zhì)。因此，HMGB1是治療敗血癥的更有效靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，DIM可以降低LPS誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α和HMGB1的mRNA水平，提示DIM可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎因子的產(chǎn)生。

TLR-4在心肌細(xì)胞表面表達(dá)，在LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷中起重要作用。TLR4可識(shí)別LPS，通過(guò)MYD88依賴(lài)性途徑引起NF-κB入核，啟動(dòng)炎癥因子轉(zhuǎn)錄[17]，亦可激活下游MAPKs途徑[18]。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了TLR-4/MAPKs信號(hào)通路是否參與了DIM對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示DIM顯著抑制TLR-4、p-ERK1/2、p-P38和p-JNK等蛋白水平。因此，TLR-4/MAPKs信號(hào)通路參與DIM對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用，進(jìn)而抑制促炎細(xì)胞因子IL-6，TNF-α和HMGB1的過(guò)量產(chǎn)生。

與對(duì)照組比較，*1P<0.05；與LPS組比較，*2P<0.05。圖3 各組心肌IL-6、TNF-α和HMGB1的mRNA表達(dá)水平Compared with control group，*1P<0.05；compared with LPS group，*2P<0.05.Fig.3 The mRNA expression levels of IL-6,TNF-α and HMGB1 of cardiomyocytes in all groups

本研究結(jié)果為治療膿毒癥提供了新的治療靶點(diǎn)，但本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了炎癥指標(biāo)，未檢測(cè)氧化應(yīng)激水平，沒(méi)有體現(xiàn)心功能的變化及DIM對(duì)膿毒癥動(dòng)物模型生存率的影響，因此存在一定的局限性，需進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論。

綜上所述，DIM可以通過(guò)抑制TLR-4/MPAKs信號(hào)通路降低心肌細(xì)胞內(nèi)炎癥因子水平，對(duì)LPS誘導(dǎo)的新生大鼠炎癥損傷心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。今后將進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探討DIM對(duì)膿毒癥的更多作用及其機(jī)制，為DIM預(yù)防膿毒癥展示更廣闊的前景。

與對(duì)照組比較，*1P<0.05；與LPS組比較，*2P<0.05。圖4 DIM抑制LPS激活的TLR-4 /MAPKs信號(hào)通路Compared with control group,*1P<0.05；compared with LPS group，*2P<0.05.Fig.4 Inhibition of DIM on LPS-induced TLR-4/MAPKs signaling pathways