張敏，董嘉皓，李斐，肖素蕓，袁金斌

(1.南昌市食品藥品檢驗所南昌市中藥質(zhì)控與安全性評價重點實驗室，南昌 330015；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)科研實踐班，南昌 330004)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸[Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.]、石虎[Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang]或疏毛吳茱萸[Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang]的干燥近成熟果實[1]。吳茱萸性味辛、苦、熱，有小毒；具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉等功效。現(xiàn)代研究表明，吳茱萸中含有多種化學(xué)成分，主要為生物堿類、檸檬苦素類、揮發(fā)油類、木脂素、黃酮、多糖等[2]，其中生物堿類為其主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用[3-4]。

吳茱萸生物堿類成分眾多，主要包括吲哚喹啉類和喹諾酮類生物堿。目前關(guān)于吳茱萸質(zhì)量控制方面的研究多集中于吲哚喹啉類生物堿(如吳茱萸堿和吳茱萸次堿)的含量測定[1，5-10]，較少涉及其他生物堿。文獻(xiàn)表明去氫吳茱萸堿和吳茱萸新堿是吳茱萸所特有的生物活性成分[2，10]，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)二者的含量相對較高[11-13]，在討論吳茱萸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制方法時，有必要將二者列入考慮范圍。

本實驗擬以去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸新堿為含測指標(biāo)，通過優(yōu)化高效液相色譜(HPLC)條件，建立一種同時測定吳茱萸生物堿的方法，并對其進(jìn)行系統(tǒng)驗證，以期為研究吳茱萸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供前期研究基礎(chǔ)，為吳茱萸藥材及其飲片的質(zhì)量控制提供可靠的分析方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260 series高效液相色譜儀(包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器)；Mettler AE 240電子天平(瑞士Mettler公司，感量：0.000 1 g)；PS-80A超聲波清洗機(jī)(東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司)；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；116B搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)。

1.2試藥 吳茱萸藥材采自江西省新干市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)曹嵐副教授鑒定為蕓香科植物石虎[Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang]的干燥近成熟果實。去氫吳茱萸堿對照品購自上海源葉生物科技有限公司(批號：B21028)，吳茱萸新堿對照品購自上海胤珂生物科技有限公司(批號：15266-38-3)，吳茱萸堿對照品(批號：110802-200504)、吳茱萸次堿對照品(批號：0801-9702)購自中國食品藥品檢定研究院。所有對照品標(biāo)示含量均大于98.5%(HPLC分析)。乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，以甲醇溶解并定容，得單一成分對照品溶液。再分別取上述4個對照品溶液各1 mL加入10 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，得混合對照品儲備溶液?；鞓?biāo)溶液中，各對照品的濃度分別為：去氫吳茱萸堿503 μg·mL-1、吳茱萸堿501 μg·mL-1、吳茱萸次堿503 μg·mL-1和吳茱萸新堿511 μg·mL-1。

2.2供試品溶液的制備 吳茱萸藥材凈制，放入60 ℃烘箱，烘2 h，粉碎，稱取約0.3 g(過孔徑355 μm篩)，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h后超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過孔徑0.22 μm濾膜，備用。

2.3色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)；梯度洗脫：0～10 min，17%→21%A；10～12 min，21%→40%A；12～15 min，40%→44%A；15～17 min，44%A；17～18 min，44%→60%A；18～28 min，60%→75%A；28～30 min，75%→100%A；30～35 min，100%A。流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：326 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.4系統(tǒng)適用性實驗及專屬性考察 將混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑分別按照“2.3”項下色譜條件分別進(jìn)樣檢測，色譜圖見圖1?？芍?，空白溶劑在去氫吳茱萸堿峰、吳茱萸堿峰、吳茱萸次堿峰和吳茱萸新堿峰位置處均無吸收峰，即溶劑對測定無干擾；供試品溶液中，4種組分峰均與其他組分峰達(dá)到基線分離，分離度>1.5，且與混合對照品溶液中4種組分峰的保留時間一致。

2.5線性關(guān)系考察 逐級稀釋“2.1”項混合對照品溶液，得6個濃度系列的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣分析。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析。得回歸方程分別為：去氫吳茱萸Y=9808.2X-23.844(R2=0.999 5)，吳茱萸堿堿Y=1691.6X-3.8455 (R2=0.999 5)，吳茱萸次堿Y=29413X+6.062 7(R2=0.999 7)，吳茱萸新堿Y=8259.8X-4.184 7(R2=0.999 7)。去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿的線性范圍分別為2.52～503，2.50～501，2.52～503和2.56～511 μg·mL-1。

2.6精密度實驗 精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，以峰面積計算RSD值，得去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿的RSD值分別為0.7%，0.6%，0.5%，0.8%。

2.7重復(fù)性實驗 取同一批吳茱萸藥材6份，按“2.1”項下供試品溶液制備方法和“2.3”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算含量，以 6次含量的RSD評價方法的重復(fù)性。去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸新堿RSD值分別為1.0%，1.1%，1.6%，1.3%。

2.8穩(wěn)定性實驗 取吳茱萸粉末，制備，分別室溫下靜置0，2，4，6，12，24，48 h后再按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積計算RSD值，去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿RSD值分別為1.1%，0.8%，1.0%，1.1%。

2.9加樣回收率實驗 精密稱取己知含量的同一吳茱萸粉末6份，分別精密加入相當(dāng)于樣品100%含量的去氫吳茱萸堿(0.313 mg·mL-1)、吳茱萸堿(0.456 mg·mL-1)、吳茱萸次堿(0.235 mg·mL-1)和吳茱萸新堿(0.146 mg·mL-1)的對照品1 mL，制備，按上述的色譜條件進(jìn)樣，計算加樣回收率。其平均回收率(RSD)分別為：去氫吳茱萸堿，98.4%(2.4%)；吳茱萸堿98.7%(2.4%)；吳茱萸次堿，100.9%(2.4%)和吳茱萸新堿，101.1%(2.4%)。

2.10不同產(chǎn)地樣品的含量測定 取不同產(chǎn)地的吳茱萸藥材10批，分別按“2.3”項下供試品溶液制備方法和“2.2”項下色譜條件制備和進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖2。10批不同產(chǎn)地吳茱萸中4種成分的含量結(jié)果見表1。

A.空白溶劑；B.對照品；C.供試品；1.去氫吳茱萸堿；2.吳茱萸堿；3.吳茱萸次堿；4.吳茱萸新堿。圖1 3種溶液的HPLC色譜圖A.blank solution；B.reference；C.samples；1.dehydroevodiamine;2.evodiamine;3.rutaecarpin;4.evocarpine.Fig.1 HPLC chromatogram of three kinds of solution

S1.江西樟樹1；S2.江西樟樹2；S3.江西豐溪1；S4.江西豐溪2；S5.江西新干；S6.湖南新晃；S7.湖南沅江；S8.云南昭通；S9.云南曲靖；S10，貴州凱里；1.去氫吳茱萸堿；2.吳茱萸堿；3.吳茱萸次堿；4.吳茱萸新堿。圖2 不同產(chǎn)地的吳茱萸色譜圖S1.Zhangshu 1,Jiangxi;S2.Zhangshu 2,Jiangxi;S3.Fengxi 1,Jiangxi;S4.Fengxi 2,Jiangxi;S5.Xingan,Jiangxi;S6.Xinhuang,Hunan;S7.Yuanjiang,Hunan;S8.Zhaotong,Yunnan;S9.Qujing,Yunnan;S10.Kaili,Guizhou;1.dehydroevodiamine;2.evodiamine;3.rutaecarpin;4.evocarpine.Fig.2 Chromatograms of Euodia rutaecarpa from different origins

表1 10批不同產(chǎn)地吳茱萸4種生物堿含量測定結(jié)果Tab.1 Results of content determination on ten batches of four alkaloids in Euodia Rutaecarpa from different origins %，n=6

3 討論

3.1流動相的選擇 本實驗考察乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.2%醋酸溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液，發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.1%磷酸溶液下4種成分的色譜峰分離效果較好，可達(dá)到完全分離，且出峰時間適中。因此選用了乙腈-0.1%磷酸溶液為本實驗的流動相。

3.2提取溶劑的選擇 吳茱萸生物堿是脂溶性化合物，易溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、乙酸乙酯溶液等。從環(huán)境友好和經(jīng)濟(jì)適用的角度看，乙醇是最佳的提取溶劑。前期實驗[10]表明吳茱萸生物堿進(jìn)行提取用濃度為70%的乙醇，生物堿得率最高。因此，本實驗使用的提取溶劑為70%乙醇。

3.3檢測波長的選擇 文獻(xiàn)中有關(guān)吳茱萸堿和吳茱萸次堿的檢測波長多設(shè)置為215和225 nm[8-10]，本實驗發(fā)現(xiàn)波長設(shè)置為215和225 nm時，吳茱萸堿和吳茱萸次堿中有個小峰，使二者的分離度均小于1.5，且基線漂移較大。當(dāng)以DAD檢測器在190～400 nm波長下進(jìn)行全波長掃描時發(fā)現(xiàn)該雜質(zhì)峰在326 nm處無吸收，而4個目標(biāo)化合物均有合適的響應(yīng)，且色譜圖的基線平穩(wěn)，各色譜峰峰的分離度都大于1.5，故檢測波長選擇為326 nm。

3.4不同產(chǎn)地樣品的含量分析 從圖2和表1可知，不同產(chǎn)地吳茱萸中化學(xué)成分含量的差異較大。其中吳茱萸堿和次堿在各個樣品中的含量差異最大，去氫吳茱萸堿含量差異相對較小。按《中華人民共和國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)，樟樹1#和豐溪的3個樣品竟為不合格產(chǎn)品，具體原因尚需進(jìn)一步調(diào)查取樣。

吲哚喹啉類、喹諾酮類生物堿是吳茱萸中的兩類主要生物堿，去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸新堿是這兩類生物堿的典型代表，特征性強(qiáng)，含量相對比較豐富。筆者首次將代表喹諾酮類生物堿的吳茱萸新堿納入到吳茱萸的含測指標(biāo)，更能反映吳茱萸藥材的質(zhì)量屬性。

在充分優(yōu)化分析條件的基礎(chǔ)上，本文建立了吳茱萸中4種生物堿的HPLC同時測定方法，并對其進(jìn)行嚴(yán)格的方法學(xué)驗證。該方法簡單、穩(wěn)定、可靠，可用于吳茱萸藥材及其飲片的質(zhì)量評價。