張玉萌，何新榮，栗曉東，魏 靜（.中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)保障部藥學(xué)部中藥房，北京 0085；.北京交通大學(xué)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 00044；.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 00070）

創(chuàng)面治療是臨床醫(yī)學(xué)上獨具挑戰(zhàn)的難題之一，其治療是一個復(fù)雜且動態(tài)的過程，且愈合機制具有多樣性[1]，其中創(chuàng)面感染是創(chuàng)面難治愈的重要原因[2]，有臨床報道創(chuàng)口感染是致死的主要原因[3]，而近年來抗生素的濫用、誤用使得機體產(chǎn)生耐藥性的問題不容忽視[4-5]。在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，長期臨床實踐證明有不少中草藥作為一種天然的抗菌藥物，其通過調(diào)整機體功能狀態(tài)實現(xiàn)抑菌作用[6]，因此，用中草藥代替化學(xué)藥物治療創(chuàng)面感染疾病，無殘留、無耐藥性、無毒副作用的優(yōu)點而具有遠大發(fā)展前景。黃硝創(chuàng)傷方為臨床經(jīng)驗方，由五倍子、大黃、芒硝、白及和甘草組成，具有清熱消腫、斂瘡生肌等功效，臨床上外用主治戰(zhàn)、創(chuàng)傷等外傷出血證，有很好的止血、止痛、消腫生肌的藥效。本試驗擬以體外抑菌作用為指標，采用正交t值法對黃硝創(chuàng)傷方中主要藥味進行分析及優(yōu)化組合研究，進而進行抑菌試驗，旨為開發(fā)黃硝創(chuàng)傷方在臨床中的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

大黃（產(chǎn)地：四川；生產(chǎn)批號：17062001）、生甘草（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古；生產(chǎn)批號：17060901）、五倍子（產(chǎn)地：四川；生產(chǎn)批號：17072502），以上三種藥材均購于北京綠野藥業(yè)有限公司；芒硝（產(chǎn)地：陜西；生產(chǎn)批號：1707096）購自北京盛世龍藥業(yè)有限公司；白及粉（產(chǎn)地：貴州；生產(chǎn)批號：SA6151）購自北京華邈藥業(yè)有限公司。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基由中國人民解放軍總醫(yī)院檢驗中心微生物室按要求配制。

1.2 實驗菌種

金黃色葡萄球菌ATCC25933 標準菌株，臨床耐藥菌株腸球菌（青霉素G、氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素、利奈唑烷、萬古霉素、四環(huán)素、替加環(huán)素、呋喃妥因均耐藥），由中國人民解放軍總醫(yī)院微生物科提供。

1.3 儀器與設(shè)備

YB-400A型中藥粉碎機（永康市速鋒工貿(mào)有限公司），HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱（常州市固德儀器有限公司），JC-STZK18L壓力蒸汽滅菌鍋（青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司），F(xiàn)A-1004電子天平（上海精科儀器有限公司），DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），DHP060型恒溫培養(yǎng)箱（上海實驗儀器廠有限公司），101A 系列電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司），SW-CJ-1F醫(yī)用型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）。

2 實驗方法

2.1 設(shè)計及分組

處方中5 味中藥構(gòu)成5 個因素，各因素均取用藥為水平1、不用藥為水平2，因素水平見表1。選用 L12（211）正交表，按照正交設(shè)計安排12組實驗，拆方方法見表2、表3。

2.2 中藥提取物的制備

根據(jù)處方組成，分別稱取大黃、芒硝、五倍子各30 g，生甘草10 g，白及粉10 g（包煎）若干份，按正交t 值表安排，將不同配伍的藥物粉碎，用適量水浸泡2 h，加入八倍量水煎煮兩次，每次30 min，兩次藥液合并，濃縮至40 mL，高溫滅菌，密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 正交 t 值法因素水平表Tab 1 Factor level table of orthogonal t value method

表2 黃硝創(chuàng)傷方及其拆方對金黃色葡萄球菌抑菌效果Tab 2 Antibacterial effect of HX and its different components against Staphylococcus aureus

表3 黃硝創(chuàng)傷方及其拆方對腸球菌抑菌效果Tab 3 Antibacterial effect of HX and its different components against Enterococcus

2.3 體外抑菌實驗

2.3.1 培養(yǎng)基的制備 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖0.1%，氯化鈉5 g，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)pH 6.7 ～ 7.5，滅菌25 min。

2.3.2 藥敏片法 將在藥液中充分浸泡好的圓紙片，放入有菌的培養(yǎng)基表面，室溫下培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，濾紙片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈及其直徑大小可作為判斷細菌對該藥物的敏感程度的指標。

2.3.3 制作藥敏片 在無菌培養(yǎng)皿中倒入5 mL藥液，用鑷子將濾紙片放入浸泡至充分，取出后放入無菌操作臺高溫干燥待用。

2.3.4 抑菌實驗 在無菌操作臺上，將金黃色葡萄球菌、臨床耐藥腸球菌分別劃線接種于平皿培養(yǎng)基上，振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，用接種環(huán)挑取適量的細菌培養(yǎng)物，均勻地涂布于瓊脂培養(yǎng)基上。用鑷子將干燥后的藥敏片平貼于培養(yǎng)基表面，使其與表面完全貼合，將瓊脂培養(yǎng)基倒置放入培養(yǎng)箱中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，用游標卡尺測量直徑，3次測量取平均值。實驗操作中使用的儀器均經(jīng)過滅菌處理。

2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)拆方對2種供試菌D值的貢獻分析確定黃硝創(chuàng)傷方優(yōu)化組合。D值為正值，表示用該藥比不用該藥對試驗菌的抑菌圈大，差異顯著，表明抑菌效果顯著；D值為負值，表示用該藥比不用該藥對試驗菌的抑菌圈小，差異顯著，表明無抑菌效果，并對該方優(yōu)化組合方進行驗證試驗。預(yù)期藥效（MM）計算公式為MM=Mm+，其中Mm為各組抑菌圈直徑均數(shù)的平均值，D= M1- M2，M1為用某藥各組抑菌圈直徑的均數(shù)之和，M2為未用某藥各組抑菌圈直徑的均數(shù)之和，G為分組組數(shù)。

3 結(jié)果

黃硝創(chuàng)傷方拆方的抑菌試驗結(jié)果見表2 和表3，由表2 可知，對金黃色葡萄球菌的最佳抑菌組合為A1B1C1D1E2，預(yù)期藥效MM1= 15.31+（46.49+ 36.23+10.59+12.71+8.11）/12 = 24.8 mm，且用E與不用差異不顯著，說明五倍子、大黃、白及和芒硝為抑制金黃色葡萄球菌的主藥。由表3可知，對腸球菌的最佳抑菌組合為A1B1C2D2E2，預(yù)期藥效MM2= 11.55+（27.91+27.53+3.57+8.47+1.59）/12 = 17.3 mm，且用C、D、E 與不用差異不顯著，說明五倍子、大黃為抑制腸球菌的主藥。根據(jù)拆方對2種供試菌D值的貢獻分析確定黃硝創(chuàng)傷方的優(yōu)化藥物組合為五倍子和大黃。驗證試驗證明該組合對金黃色葡萄球菌和臨床耐藥腸球菌的抑菌圈直徑分別為（19.89±1.11） mm 和（15.58±1.63） mm，五倍子與大黃配伍，對金黃色葡萄球菌有協(xié)同抑制作用，而對腸球菌無協(xié)同作用。

4 討論

正交t 值法原理清晰明了，易于實驗操作和數(shù)據(jù)計算，改進后便于分析，多用于因素多、水平少的較大方劑研究，尤其對4 ～ 11味藥物適用[7-9]。該方法可進行主要藥效分析、輔藥交互分析及劑量選擇，較適用于中藥復(fù)方的最佳組合篩選研究。本研究采用正交t 值法作為上述5 種抗炎植物有效成分進行最佳有效成分配伍的篩選工具，進行了有效成分優(yōu)選復(fù)方的初步篩選。結(jié)果表明，復(fù)方中五倍子和大黃為抑制金黃色葡萄球菌和臨床耐藥腸球菌的主要有效藥味，且五倍子與大黃配伍，對金黃色葡萄球菌有協(xié)同抑制作用，而對腸球菌無協(xié)同作用。

腸球菌為革蘭陽性球菌，在需氧革蘭陽性球菌中，它是僅次于葡萄球菌的重要院內(nèi)感染致病菌，腸球菌亦可引起院外感染。腸球菌不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染，還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等[10]。因此，本研究選定創(chuàng)傷易感菌金黃色葡萄球菌及耐藥性腸桿菌作為研究對象，一方面希望能為臨床中該制劑使用提供實驗性的依據(jù)，另一方面希望緩解致病菌產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)狀和減少臨床上抗菌藥物大量使用對人體的危害，并達到更好的治療效果。抑菌實驗中，除了對上述兩種革蘭陽性菌進行實驗，還選擇了2個革蘭陰性菌即標準大腸桿菌和臨床耐藥腸桿菌，但結(jié)果表明，黃硝創(chuàng)傷方各組對大腸桿菌和耐藥性腸桿菌均表現(xiàn)低敏。

本課題是在前期止血、止疼藥效研究基礎(chǔ)上，擬通過考察該經(jīng)驗處方的抑菌抗炎藥效，優(yōu)化處方大黃、芒硝、五倍子、白及和甘草的藥味組成。本經(jīng)驗方中大黃瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃[11]，藥理作用主要為瀉下、抗菌、止血、抗腫瘤。五倍子斂肺降火，化痰飲，止咳嗽、消渴，其藥效成分沒食子酸有抗菌、抗病毒、抗氧化、防齲齒等功效。芒硝瀉下通便，潤燥軟堅，清火消腫，在臨床多與其他藥物配伍使用，也常以外敷為主與大黃合用起協(xié)同作用，利于消腫抗炎。白及收斂止血、消腫生肌，有止血凝血、保護胃黏膜及抗細菌、真菌的活性?；谝陨现嗅t(yī)理論和藥理研究結(jié)果，可以推斷該中藥外治經(jīng)驗方，具有托毒生肌，活血化瘀，清熱斂瘡的功效，在臨床應(yīng)用治療戰(zhàn)、創(chuàng)傷有顯著優(yōu)勢。通過黃硝創(chuàng)傷方抑菌有效藥味優(yōu)選實驗，結(jié)果表明五倍子與大黃是主要藥味，芒硝、白及和甘草是輔助藥味，同時可以初步推斷該經(jīng)驗方對革蘭陽性菌有顯著抑制作用。下步擬通過輔藥交互作用以及劑量選擇的正交t 值法確定最佳配比和劑量，結(jié)合止痛、止血藥效實驗數(shù)據(jù)為該處方復(fù)合成新型敷合制劑提供數(shù)據(jù)依據(jù)。