氯化兩面針堿體外對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響

董濤　吳倩

[摘要] 目的 研究氯化兩面針堿體外對(duì)人喉癌細(xì)胞株Hep-2增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響。 方法 體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，以5、10、20、40、60、80 μmol/L的氯化兩面針堿作用細(xì)胞，MTT法檢測(cè)不同時(shí)間和不同濃度的氯化兩面針堿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用;Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)10、20、40 μmol/L的氯化兩面針堿對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;Transwell小室法檢測(cè)5、10 μmol/L的氯化兩面針堿對(duì)細(xì)胞的侵襲和遷移能力的影響。 結(jié)果 在5、10、20、40、60、80 μmol/L濃度范圍內(nèi)，氯化兩面針堿對(duì)Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，明顯高于對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞（P < 0.05）;在10、20、40 μmol/L范圍內(nèi)，氯化兩面針堿誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡率逐漸增多，與細(xì)胞對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與10 μmol/L氯化兩面針堿組比較，20、40 μmol/L氯化兩面針堿組Hep-2細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與細(xì)胞對(duì)照組比較，5、10 μmol/L的氯化兩面針堿可顯著降低Hep-2細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)（P < 0.05）;與5 μmol/L氯化兩面針堿組比較，10 μmol/L氯化兩面針堿組降低得更多（P < 0.05）。 結(jié)論 氯化兩面針堿可抑制人喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，該抑制作用與誘導(dǎo)其凋亡及降低其侵襲和遷移能力有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 氯化兩面針堿;Hep-2;增殖;凋亡;侵襲;遷移

[中圖分類號(hào)] R739.65? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）06（a）-0017-05

Effect of nitidine chloride on cell proliferation， apoptosis， invasion and migration in laryngeal carcinoma cell line Hep-2 in vitro

DONG Tao1? ?WU Qian2

1.Department of Pharmacy， Beijing Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Beijing? ?100039， China; 2.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Hubei University of Arts and Science? Xiangyang Central Hospital， Hubei Province， Xiangyang? ?441021， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of nitidine chloride on cell proliferation， apoptosis， invasion and migration in laryngeal carcinoma cell Hep-2 in vitro. Methods Hep-2 cells were cultured by nitidine chloride with 5， 10， 20， 40， 60， 80 μmol/L in vitro， and MTT was performed to observe the proliferation at different times. Annexin V-FITC/PI flow cytometry was used to determine the apoptosis rate by nitidine chloride with 10， 20， 40 μmol/L. Transwell method was used to detect the invasion and migration by nitidine chloride with 5， 10 μmol/L. Results At concent of 5， 10， 20， 40， 60， 80 μmol/L， the growth inhibition rate of nitidine chloride on Hep-2 cells increased gradually with the increase of time， compared with the control group at the same time point （P < 0.05）. At concent of 10， 20， 40 μmol/L， the apoptosis rate of Hep-2 cells induced by nitidine chloride gradually increased， compared with the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）; compared with the nitidine chloride with 10 μmol/L， the nitidine chloride with 20， 40 μmol/L increased the apoptosis rate， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared to the control group， nitidine chloride with 5， 10 μmol/L reduced the number of cells of invasion and migration of Hep-2 cells significantly （P < 0.05）; compared with the nitidine chloride with 5 μmol/L， nitidine chloride with 10 μmol/L decreased the number more significantly （P < 0.05）. Conclusion Nitidine chloride could inhibit the proliferation of Hep-2 cells， the mechanism is related to the induction of apoptosis and the inhibition of invasion and migration.

2.3 對(duì)Hep-2細(xì)胞體外侵襲能力的影響

5、10 μmol/L氯化兩面針堿組Hep-2細(xì)胞侵襲數(shù)與細(xì)胞對(duì)照組比較均顯著降低（P < 0.01），提示這兩個(gè)濃度的氯化兩面針堿體外可抑制Hep-2細(xì)胞的侵襲能力，該抑制能力隨濃度增加而增強(qiáng)，與5 μmol/L氯化兩面針堿組比較，10 μmol/L氯化兩面針堿組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P < 0.05）。見表2。

2.4 對(duì)Hep-2細(xì)胞體外遷移能力的影響

5、10 μmol/L的氯化兩面針堿組遷移細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞對(duì)照組比較均顯著降低（P < 0.01），濃度越大遷移細(xì)胞數(shù)越少，提示氯化兩面針堿能濃度依賴性地抑制Hep-2細(xì)胞的體外遷移，與5 μmol/L氯化兩面針堿組比較，10 μmol/L氯化兩面針堿組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（P < 0.01）。見表3。

3 討論

喉癌是發(fā)生于上呼吸道的頭頸部惡性腫瘤，93%～99%的病理分型為喉鱗狀細(xì)胞癌，發(fā)生率占世界范圍內(nèi)每年新發(fā)惡性腫瘤病例的2.4%[6]。常規(guī)治療喉癌的方法預(yù)后并不理想，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是頭頸部腫瘤影響療效和生存率的重要原因[7]。所以，既能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，又可降低其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)能力的新的治療方法是眾多學(xué)者極力尋找的。而氯化兩面針堿由于具有良好的抗癌作用，已逐漸成為抗癌藥物中的熱門研究對(duì)象。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體自發(fā)啟動(dòng)的維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)?shù)蛲鍪タ刂凭蜁?huì)引起細(xì)胞無(wú)限增殖[8]。腫瘤也稱作細(xì)胞增殖周期紊亂性疾病，其區(qū)別于其他疾病最明顯的特征就是細(xì)胞不受機(jī)體正常調(diào)節(jié)而無(wú)限制地生長(zhǎng)和繁殖。研究表明很多中藥可通過(guò)各種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而減少其增殖[9-13]，其已成為抗腫瘤的最佳治療方式。已有研究表明，氯化兩面針堿在體外可通過(guò)阻斷AKT通路誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡[14]。惡性腫瘤不同于其他疾病的另外一個(gè)特征就是能通過(guò)淋巴系統(tǒng)或內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)侵襲和遷移至其他組織[15]，并在其他組織中繼續(xù)不斷生長(zhǎng)，即為腫瘤轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移性是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗非常重要的原因[16-17]。

喉癌與細(xì)胞凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)，侵襲和遷移是喉癌易侵犯周圍組織的主要原因[18-20]，已有的手術(shù)、靶向治療和放療等多種方案對(duì)于部分喉癌早期的治療可獲得較好的效果，但是晚期患者的臨床療效欠佳，并常因喉癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移影響治療或?qū)е滤劳鯷21-22]。如能有效抑制喉癌生長(zhǎng)，并抑制其向周圍轉(zhuǎn)移，可極大地提升喉癌的治愈率。

中醫(yī)藥博大精深，用中藥制劑輔助治療癌癥已成為趨勢(shì)[23-25]，氯化兩面針堿是一個(gè)非常有前景、可防治腫瘤的中藥，其抗腫瘤的作用較廣泛，體外研究證實(shí)其能有效抑制胃癌、鼻咽癌等多種腫瘤的生長(zhǎng)[26-27]。本研究將氯化兩面針堿作用于人喉癌Hep-2細(xì)胞，分別采用MTT法、Transwell法、Annexin V-FITC/PI雙染法探討氯化兩面針堿對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制及誘導(dǎo)凋亡的潛在作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，氯化兩面針堿能顯著抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且在5～80 μmol/L的濃度和24～72 h的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著濃度和時(shí)間的增加抑制率也逐漸增加。Annexin V-FITC/PI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞的凋亡率隨著濃度的增加而升高。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，氯化兩面針堿濃度越高，Hep-2細(xì)胞侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)也越少，提示其可濃度依賴性地降低Hep-2細(xì)胞的侵襲和遷移能力。這與氯化兩面針堿可以劑量依賴性地抑制SGC-7901細(xì)胞的侵襲和遷移能力結(jié)果是一致的[28]。

綜上，氯化兩面針堿可通過(guò)誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡來(lái)抑制其生長(zhǎng)，并能減少Hep-2細(xì)胞的侵襲和遷移的數(shù)量而抑制其轉(zhuǎn)移，這為臨床治療喉癌提供了一定的研究基礎(chǔ)，但是氯化兩面針堿抑制Hep-2細(xì)胞侵襲和遷移的能力是否與時(shí)間有關(guān)，以及通過(guò)何種機(jī)制抑制其遷移，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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