靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

陳頔 唐艷斌 樸瑋 王鷗 黃建 王麗娟

摘 要：目的：研究靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用。方法：將50只健康的雌性昆明小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、靈芝子實(shí)體濃縮膠囊低（83.5mg/kg·BW）、中（167mg/kg·BW）、高劑量組（500mg/kg·BW），每組10只。每日灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃給藥37d，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組按等量蒸餾水灌胃。給予受試物第37天，模型對(duì)照組及受試物各劑量組灌胃給予50%乙醇（13mL/kg·BW）造成急性肝損傷模型，禁食16h處死動(dòng)物，測(cè)定各組小鼠肝組織中丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）、還原型谷胱甘肽（GSH）的含量并觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：各劑量組間小鼠與模型對(duì)照組相比，靈芝子實(shí)體濃縮膠囊高劑量組的MDA、TG含量明顯低于模型對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.05），中、高劑量組的GSH含量顯著高于模型對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.01）。靈芝子實(shí)體濃縮膠囊能顯著改善肝細(xì)胞腫脹、壞死和炎性浸潤(rùn)狀況，在脂肪變性方面各劑量組雖未發(fā)現(xiàn)顯著性改善，但與模型對(duì)照組比較，存在緩解肝損傷的趨勢(shì)。結(jié)論：靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的輔助保護(hù)功能。

關(guān)鍵詞：靈芝子實(shí)體濃縮膠囊;酒精性肝損傷;保護(hù)作用;還原型谷胱甘肽;丙二醛;甘油三酯

根據(jù)目前人群對(duì)保肝護(hù)肝功能性產(chǎn)品的需求和現(xiàn)狀，探尋和篩選到抗急性酒精性肝損傷的保健品日益受到重視[1-6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，靈芝在抗腫瘤[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、鎮(zhèn)靜安神、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)血脂等方面均有較好的療效[9]。靈芝中的最主要活性成分包括靈芝多糖和三萜，但對(duì)靈芝子實(shí)體這一復(fù)合體的功能研究目前偏少，本實(shí)驗(yàn)主要以急性酒精性肝損傷為模型，從而進(jìn)一步闡明靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)肝損傷小鼠的輔助保護(hù)功能。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

靈芝子實(shí)體濃縮膠囊，由醇提靈芝提取物、淀粉和硬脂酸鎂為原輔料制成，標(biāo)志性成分為總?cè)坪挽`芝多糖。靈芝子實(shí)體原料總?cè)频暮堪凑铡侗＝∈称饭πС煞謾z測(cè)方法》（2011版）中“總?cè)频姆止夤舛葴y(cè)定法”進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算;靈芝多糖含量的測(cè)定則參照《中華人民共和國(guó)藥點(diǎn)》（2015版）一部中的“靈芝”項(xiàng)下的方法進(jìn)行。經(jīng)測(cè)定，靈芝子實(shí)體原料每100g中，總?cè)频暮?.5g，以無(wú)水葡萄糖計(jì)靈芝多糖的含量為每100g8.0g。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雌性昆明小鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，體重18～22g，共計(jì)50只。許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)地點(diǎn)為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物房，級(jí)別：屏障環(huán)境，動(dòng)物房使用許可證號(hào)：SYXK（京）2013-0019。各組小鼠均給予正常基礎(chǔ)飼料，自由進(jìn)食和飲水。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 主要儀器 電子天平、離心機(jī)、Gene5全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀、加樣器、恒溫水浴鍋、混旋器、組織勻漿器、脫水機(jī)、包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、染色機(jī)、封片機(jī)、顯微鏡。

1.3.2 主要試劑 無(wú)水乙醇（新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司，批號(hào)20150905）、甲醛（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20151207）、0.9%氯化鈉溶液（石家莊四藥有限公司，批號(hào)1609053201）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成科技有限公司，批號(hào)20170528）、還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒（南京建成科技有限公司，批號(hào)20170526）、甘油三酯（TG）測(cè)定試劑盒（南京建成科技有限公司，批號(hào)20170526）。

1.4 方法

1.4.1 受試樣品劑量的確定 《中華人民共和國(guó)藥點(diǎn)》（2015版）一部的“靈芝”中，靈芝生藥飲片的用量為6～12g，按每天平均用量10g生藥飲片進(jìn)行計(jì)算，本研究選用經(jīng)過(guò)加工處理好的靈芝子實(shí)體濃縮膠囊內(nèi)容物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)綜合考慮和膠囊工藝制備的情況，最后選用濃縮倍數(shù)相當(dāng)?shù)臈l件，即確定人體對(duì)該濃縮膠囊的推薦攝入量為1g/d。

1.4.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組 健康昆明種雌性小鼠50只，按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，靈芝子實(shí)體濃縮膠囊按成人60kg體重計(jì)，受試物推薦劑量相當(dāng)于每人每日16.7mg/kg。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)按人體推薦量的5、10、30倍，即每日83.5、167、500mg/kg·BW為低、中、高劑量組。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和模型對(duì)照組。

1.4.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)方法按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）中對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用檢驗(yàn)方法中酒精肝損傷模型進(jìn)行。動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)4d后，各劑量組灌胃給予受試物，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予蒸餾水，灌胃量10mL /kg·BW，連續(xù)37d，每天1次。動(dòng)物每周稱重2次，按體重調(diào)整灌胃量。給予受試物第37天，模型對(duì)照組及受試物各劑量組灌胃給予50%乙醇，灌胃量為13mL/kg·BW，造成急性酒精性肝損傷模型，空白對(duì)照組給予蒸餾水，禁食16h處死動(dòng)物，剖取小鼠肝臟左葉用10%甲醛固定，在肝組織中部做橫切面取材，-20℃恒冷低溫條件下切片（厚6μm），光鏡下做病理組織學(xué)檢查;另取肝臟用生理鹽水制成10%的肝勻漿，檢測(cè)肝組織中MDA、TG、GSH的含量。乙醇中毒小鼠肝臟病理組織學(xué)變化與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：對(duì)每張病理切片全面進(jìn)行觀察（不得遺漏任何視野），觀察脂肪滴在肝臟的分布、范圍和面積，分別記錄每個(gè)視野中的各種病變所占據(jù)視野的面積，累計(jì)所觀察視野的病變總分，并根據(jù)脂肪改變程度進(jìn)行量化，按“-（0分）、+（1分）、++（2分）、+++（3分）、++++（4分）”;量化積分：肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在、稀少，0分;含脂滴的肝細(xì)胞不超過(guò)1/4，1分;含脂滴的肝細(xì)胞不超過(guò)1/2，且超過(guò)1/4，2分;含脂滴的肝細(xì)胞不超過(guò)3/4，且超過(guò)1/2，3分;肝組織幾乎被脂滴替代，4分。肝臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞腫脹和壞死程度的量化和積分標(biāo)準(zhǔn)同脂肪變性相同。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 717.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各劑量組與模型對(duì)照組比較采用方差分析，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

1.6 結(jié)果判定

肝臟MDA、TG和還原型GSH三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性，或肝臟MDA、TG和還原型GSH三項(xiàng)指標(biāo)中任兩項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性和病理組織學(xué)檢查結(jié)果陽(yáng)性，即可判定受試樣品對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)小鼠體重的影響

由表1可知，小鼠各劑量組及模型對(duì)照組動(dòng)物初始體重和終體重與空白對(duì)照組動(dòng)物體重比較，差異均無(wú)顯著性（P>0.05），表明靈芝子實(shí)體濃縮膠囊在本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)小鼠的體重?zé)o明顯影響。

2.2 靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)動(dòng)物肝組織中MDA的影響

由表2可見(jiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的MDA明顯高于空白對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.01），說(shuō)明乙醇引起了小鼠組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。靈芝子實(shí)體濃縮膠囊低、中、高劑量組小鼠肝臟的MDA含量有所降低并呈一定的劑量關(guān)系，其中，與模型組比較，靈芝子實(shí)體濃縮膠囊500mg/kg·BW劑量組的MDA明顯低于模型對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.05），其他各劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但MDA含量也逐漸減少。

2.3 靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)動(dòng)物肝組織中TG的影響

由表3可見(jiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的TG明顯高于空白對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.01），說(shuō)明乙醇所致急性肝損傷小鼠肝臟TG能力顯著降低。靈芝子實(shí)體濃縮膠囊500mg/kg·BW劑量組的TG與模型對(duì)照組比較，明顯低于模型對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.05）。

2.4 靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)動(dòng)物肝組織中還原型GSH的影響

由表4可見(jiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的GSH明顯低于空白對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.05），說(shuō)明急性酒精性肝損傷模型造模成功。靈芝子實(shí)體濃縮膠囊167、500mg/kg·BW劑量組的GSH明顯高于模型對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.01）。

2.5 靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)肝組織病理檢查結(jié)果的影響

如附圖所示，對(duì)酒精性肝損傷小鼠的肝組織進(jìn)行HE染色，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。從肝臟外觀來(lái)看，空白對(duì)照組肝組織色澤鮮紅，肉眼未見(jiàn)明顯病變，模型組和各劑量給藥組肝組織表面色澤發(fā)黃，且肉眼可見(jiàn)組織紋理粗糙，但模型組病變最為明顯。病理切片結(jié)果顯示，空白對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈周圍為中心成板狀排列，位于中央肝結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理變化。模型對(duì)照組小鼠視野內(nèi)幾乎所有肝細(xì)胞高度腫脹、界限不清，靜脈周圍部分區(qū)域炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞脂肪變性明顯，且出現(xiàn)肝細(xì)胞灶性壞死，表明造模成功。靈芝子實(shí)體濃縮膠囊低、中、高劑量組肝組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞脂肪變性、炎性浸潤(rùn)等情況，與模型對(duì)照組比較有所恢復(fù)，脂肪病變程度有所減輕，但顯著性并不明顯，而炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度則高劑量組顯著優(yōu)于模型對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞腫脹方面，靈芝子實(shí)體濃縮膠囊各劑量組與模型對(duì)照組比較均有顯著性差異（P<0.05），高劑量組病變程度積分最低，細(xì)胞壞死程度除模型組出現(xiàn)個(gè)例壞死外，其他各劑量組均未觀察到明顯細(xì)胞壞死現(xiàn)象。由表5～8可見(jiàn)，在肝組織病理檢查中，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的肝臟脂肪改變、炎性浸潤(rùn)、細(xì)胞腫脹和壞死的程度明顯高于空白對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.05），說(shuō)明急性酒精性肝損傷模型造模成功。靈芝子實(shí)體濃縮膠囊各劑量組的肝臟脂肪改變程度與模型對(duì)照組比較，脂肪變性存在減緩的趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性（P>0.05），炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度以高劑量組與模型對(duì)照組比較差異具有顯著性（P<0.05），細(xì)胞腫脹和壞死程度各劑量組與模型組比較均存在顯著性差異（P<0.05）。

3 討論

本研究中靈芝子實(shí)體濃縮膠囊為靈芝提取物，其主要成分為總?cè)坪挽`芝多糖，靈芝多糖的保健功能多集中于降血糖、降血脂、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等[11-17]，而靈芝總?cè)频墓πС煞謩t多體現(xiàn)于抗腫瘤、保肝、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性等作用[18]。本實(shí)驗(yàn)主要從小鼠肝組織中MDA、TG和GSH三項(xiàng)指標(biāo)與肝組織病理的改變，進(jìn)而觀察靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響，結(jié)果表明，模型組MDA、TG、GSH水平均與空白對(duì)照組有顯著性差異，表明造模成功。靈芝子實(shí)體濃縮膠囊明顯降低急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、TG的含量，提高肝組織中GSH水平，由此提示，靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷肝臟的保護(hù)作用可能與其增強(qiáng)機(jī)體自由基的清除能力，抑制自由基反應(yīng)，抗脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)，這與賀國(guó)芳[19]、張?zhí)m蘭[16]、薛承斌等[20]對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究結(jié)果一致。肝臟病理組織形態(tài)學(xué)方面，結(jié)果表明，雖然統(tǒng)計(jì)結(jié)果脂肪變性指標(biāo)未表現(xiàn)出模型組與各劑量組的顯著性差異，但與模型組比較，各劑量組肝細(xì)胞脂肪變性程度有所緩解，脂肪病變程度減輕，積分降低，而炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度則高劑量組對(duì)模型組顯著性改善，結(jié)合生化指標(biāo)分析，這與肝組織TG水平變化基本一致，此研究結(jié)果與喬靖怡等[21]在金絲桃苷對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用一文中的結(jié)果大致相同。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靈芝子實(shí)體膠囊對(duì)小鼠的急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化、清除和抑制機(jī)體自由基能力等因素相關(guān)，這與先前大量的調(diào)查研究結(jié)果保持一致，因此，靈芝子實(shí)體濃縮膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠具有一定的保肝作用?！?/p>

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