李金洲 陳勇 陳子雋 呂培群 林玉港 盧慧敏 黃艷茹

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）20-2807-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.14

摘 要 目的：建立水石榴中總黃酮的含量測(cè)定方法，并優(yōu)化其提取工藝。方法：以三氯化鋁為顯色劑，采用紫外-可見光分光光度法測(cè)定水石榴中總黃酮的含量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)為考察因素，以水石榴中總黃酮含量為指標(biāo)，采用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選對(duì)總黃酮含量有顯著影響的因素，利用最陡爬坡試驗(yàn)確定最佳取值范圍，再結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化總黃酮的提取工藝。結(jié)果：總黃酮的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.012～0.036 mg/mL（r=0.999 9）;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%;加樣回收率為92.98%～99.86%（RSD=2.71%，n=6）。優(yōu)化所得提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶ 34（g/mL），提取次數(shù)3次，提取時(shí)間60 min，提取溫度80 ℃;在此工藝條件下，水石榴中總黃酮的平均含量為2.71%（RSD=1.69%，n=6），與模型預(yù)測(cè)值（2.64%）的相對(duì)誤差為2.65%。結(jié)論：所建含量測(cè)定方法穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可用于測(cè)定水石榴中總黃酮的含量;優(yōu)化所得提取工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 水石榴;總黃酮;提取工藝;Plackett-Burman試驗(yàn);Box-Behnken響應(yīng)面法;紫外-可見光分光光度法;含量測(cè)定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for content determination of total flavonoids from Combretum alfrdii， and to optimize the extraction technology of total flavonoids from C. alfrdii. METHODS： Using aluminium trichloride as， chromogenic agent， UV spectrum was adopted to determine the content of total flavonoids from C. alfrdii. Based on single factor test， ethanol volume fraction， material-liquid ratio， extraction time， extraction temperature and times were selected as investigation factors， and the content of total flavonoids was selected as response value， Plackett-Burman design was used to screen the factors that had significant influence on the content of total flavonoidsfrom C. alfrdii. Then steepest climbing test was adopted to confirm the optimum valuing range; the extraction technology of total flavonoids was optimized by Box-Behnken response methodology. RESULTS： The linear range of total flavonoids were 0.012-0.036 mg/mL （r=0.999 9）; RSDs of precision， stability and repeatability tests were less than 3%; the recovery ranged from 92.98% to 99.86% （RSD=2.71%， n=6）. The optimal extraction technology included that 60% ethanol， material-liquid ratio of 1 ∶ 34 （g/mL）， extracting for 3 times， lasting for 60 min， extraction temperature of 80 ℃. Under this technology， average content of total flavonoids from C. alfrdii was 2.71% （RSD=1.69%， n=6）， and the relative error was 2.65% compared with predicted value of the model （2.64%）. CONCLUSIONS： Established method is stable and reproducible， and can be used for content determination of total flavonoids from C. alfrdii. The optimized extraction method is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Combretum alfrdii; Total flavonoids; Extraction technology; Plackett-Burman experiment; Box-Behnken response surface methodology; UV spectrophotometry; Content determination

水石榴為使君子科風(fēng)車子屬植物風(fēng)車子（Combretum alfrdii Hance）的干燥根、莖、葉，別名水番桃、清涼樹，是廣西壯族和瑤族等少數(shù)民族常用藥材，主產(chǎn)于廣西、廣東、云南等地，其性平、淡，味微苦、甘，常被用于治療黃疸型肝炎、蛔蟲病、消化不良等疾病[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，水石榴主要含有二苯乙烯類、三萜類、菲類及黃酮類等化學(xué)成分[2]。黃酮類化合物廣泛存在于多種植物中，對(duì)心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)均具有較好的藥理作用[3-4]。目前對(duì)于水石榴的研究主要集中在其化學(xué)成分研究方面[5-7]，尚未見對(duì)其黃酮類成分的提取工藝及含量測(cè)定的相關(guān)研究。為此，本研究采用紫外-可見光分光光度法測(cè)定水石榴中總黃酮的含量，通過Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其總黃酮的提取工藝，旨在為水石榴中總黃酮的質(zhì)量控制以及藥材資源的有效利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV1780型紫外-可見光分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）;SQP型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）;SDFY-200A型高速萬能粉碎機(jī)（上海比朗儀器有限公司）;UPC-11-10T型優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

蘆丁對(duì)照品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：131105，純度：≥99%）;三氯化鋁（分析純，廣東光華科技股份有限公司）;乙醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）;水為超純水。

1.3 藥材

水石榴藥材（編號(hào)：S1～S10），來源見表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院郭敏副教授鑒定為使君子科風(fēng)車子屬植物風(fēng)車子（C. alfrdii Hance）的干燥莖與葉。藥材經(jīng)粉碎后，過50目篩，密封保存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 水石榴中總黃酮的含量測(cè)定

采用紫外-可見光分光光度法測(cè)定水石榴中總黃酮的含量。

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品12.0 mg，置于50 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋并定容，即得質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取藥材樣品粉末1.00 g，置于50 mL錐形瓶中，加70%乙醇30 mL，稱定質(zhì)量，于70 ℃水浴加熱回流提取1 h，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 顯色劑的制備 取三氯化鋁18.10 g，置于1 000 mL量瓶中，加水溶解并定容，即得1%三氯化鋁水溶液。

2.1.4 空白對(duì)照溶液的制備 取70%乙醇1 mL，置于10 mL量瓶中，精密加入“2.1.3”項(xiàng)下1%三氯化鋁水溶液5 mL進(jìn)行顯色反應(yīng)，加70%乙醇定容，作為空白對(duì)照溶液。

2.1.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 以上述空白對(duì)照溶液在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行基線調(diào)零，取對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。由圖1可知，對(duì)照品溶液、供試品溶液分別在410、406 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，空白對(duì)照溶液在對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)處均無吸收，故確定406 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.6 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加“2.1.4”項(xiàng)下1%三氯化鋁水溶液5 mL進(jìn)行顯色反應(yīng)，再加70%乙醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.012、0.018、0.024、0.030、0.036 mg/mL的系列線性工作溶液。將上述工作溶液于45 ℃水浴加熱20 min后，冷卻至室溫，于406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁回歸方程為y=24.093 4x+0.017 410 3（r=0.999 9），結(jié)果表明蘆丁在0.012～0.036 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 mL，按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色反應(yīng)并定容后，于406 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果，蘆丁吸光度的RSD=0.17%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S10）1 mL，按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色反應(yīng)并定容后，分別于室溫下放置5、10、20、30、40、50、60 min時(shí)，于406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，蘆丁吸光度的RSD=0.74%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置60 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材樣品粉末（編號(hào)：S10），共6份，每份1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色反應(yīng)并定容后，于406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。并入計(jì)算方法按公式[總黃酮含量（%）=c測(cè)×DV1/mV2×100%。式中，c測(cè)為總黃酮的實(shí)際測(cè)得濃度，D為稀釋倍數(shù)，V1為溶劑體積，m為藥材樣品質(zhì)量，V2為取樣量]計(jì)算樣品中總黃酮的含量。結(jié)果，總黃酮的平均含量為1.75%，RSD=2.46%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取藥材樣品粉末（編號(hào)：S10），共6份，每份0.2 g，分別加入質(zhì)量濃度為0.218 mg/mL的對(duì)照品溶液16 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色反應(yīng)并定容后，于406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.1.11 樣品含量測(cè)定 取10批藥材樣品粉末各約1.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色反應(yīng)并定容后，于406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。平行操作3次，并按“2.1.9”項(xiàng)下公式計(jì)算總黃酮的含量。結(jié)果，10批藥材樣品中總黃酮的平均含量為1.70%～2.10%。

2.2 水石榴中總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行水石榴中總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 取藥材樣品粉末，共15份，每份1.0 g，分為5組，固定料液比為1 ∶ 30（g/mL）、提取次數(shù)為1次、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為60 min的條件下，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%、30%、50%、70%、95%）對(duì)總黃酮含量的影響，詳見圖2A。由圖2A可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，藥材提取后總黃酮的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì);當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，總黃酮的含量最高，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇。

2.2.2 料液比 取藥材樣品粉末，共15份，每份1.0 g，分為5組，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取次數(shù)為1次、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為60 min的條件下，考察不同料液比（1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50，g/mL）對(duì)水石榴中總黃酮含量的影響，詳見圖2B。由圖2B可知，隨著料液比的增加，藥材提取后總黃酮的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì);當(dāng)料液比>1 ∶ 20（g/mL）時(shí)，總黃酮的含量增加不明顯?？紤]節(jié)約溶劑，故選擇料液比為1 ∶ 20（g/mL）。

2.2.3 提取溫度 取藥材樣品粉末，共15份，每份1.0 g，分為5組，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1 ∶ 30（g/mL）、提取次數(shù)為1次、提取時(shí)間為60 min的條件下，考察不同提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對(duì)總黃酮含量的影響，詳見圖2C。由圖2C可知，隨著提取溫度的增加，總黃酮的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì);當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，總黃酮的含量最高，繼續(xù)增加提取溫度，其含量不再增加，故選擇提取溫度為80 ℃。

2.2.4 提取時(shí)間 取藥材樣品粉末，共15份，每份1.0 g，分為5組，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1 ∶ 30（g/mL）、提取次數(shù)為1次、提取溫度為70 ℃的條件下，考察不同提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）對(duì)總黃酮含量的影響，詳見圖2D。由圖2D可知，隨著提取時(shí)間的增加，藥材提取后總黃酮的含量呈現(xiàn)先增加后略有降低的趨勢(shì)，雖然在提取時(shí)間為90 min時(shí)總黃酮的含量最高，但與提取時(shí)間為60 min時(shí)無明顯差異。考慮到節(jié)約時(shí)間和成本，故選擇提取時(shí)間為60 min。

2.2.5 提取次數(shù) 取藥材樣品粉末，共9份，每份1.0 g，分為3組，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1 ∶ 30（g/mL）、提取溫度為70 ℃、提取總時(shí)間為60 min的條件下，考察不同提取次數(shù)（1、2、3次）對(duì)總黃酮含量的影響，詳見圖2E。由圖2E可知，隨著提取次數(shù)的增加，藥材提取后總黃酮的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì);當(dāng)提取時(shí)間為3次時(shí)，總黃酮的含量最高，故選擇提取次數(shù)為3次。

2.3 水石榴中總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.3.1 Plackett-Burman試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）、提取次數(shù)（E）為考察因素，以總黃酮含量（Y）為指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)[8]，每個(gè)因素取2個(gè)水平。因素與水平見表3，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，得回歸方程為Y=2.50+0.27A+0.24B-0.04C+0.00D+0.19E（P=0.045 6<0.05），這表明方程擬合顯著性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差分析結(jié)果顯示，5個(gè)因素對(duì)總黃酮含量影響的大小順序?yàn)椋篈>B>E>C>D。

2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)總黃酮含量具有顯著性影響的因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，再根據(jù)其效應(yīng)大小，設(shè)定變化方向和步長(zhǎng)，以逼近其最佳取值范圍[9-10];同時(shí)結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定提取次數(shù)為3次、提取時(shí)間為60 min、提取溫度為80 ℃，結(jié)果見表6。

2.3.3 Box-Behnken響應(yīng)面法 在Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（E）為自變量，以總黃酮含量（Y）為因變量，采用3因素3水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)[11-12]，同時(shí)結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果確定提取時(shí)間為60 min、提取溫度為80 ℃。因素與水平見表7，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表8。

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表8數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元擬合，得Y=3.37-0.04A-0.02B+0.55E+0.06AB-0.04AE-0.05BE-0.24A2-0.33B2-0.51E2（R=0.996），這提示模型擬合度及預(yù)測(cè)性均較好。對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表9。由表9可知，所建模型擬合顯著性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明模型與實(shí)際情況吻合良好;模型失擬項(xiàng)顯著性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.073 6），表明未知因素對(duì)模型擬合結(jié)果干擾小，模型誤差較小。

2.3.4 響應(yīng)面分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（E）為響應(yīng)因子，以總黃酮含量為響應(yīng)值，繪制響應(yīng)面和等高線圖[13]，詳見圖3。 由圖3可知，在因素A與B的交互作用下，總黃酮的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì);在因素A與E的交互作用下，總黃酮的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì);在因素B與E的交互作用下，總黃酮的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。

2.3.5 最優(yōu)提取工藝的確定 基于Design-Expert 8.0.6軟件分析得到水石榴中總黃酮的最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)59.18%，料液比1 ∶ 33.63（g/mL），提取次數(shù)3.18次，提取時(shí)間60 min，提取溫度80 ℃;總黃酮含量預(yù)測(cè)值為2.64%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，確定最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶ 34（g/mL），提取次數(shù)3次，提取時(shí)間60 min，提取溫度80 ℃。

2.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最優(yōu)提取工藝平行操作6次，結(jié)果顯示，水石榴中總黃酮的平均含量為2.71%（RSD=1.69%，n=6），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.65%，提示所得最優(yōu)工藝條件穩(wěn)定、可靠。

3 討論

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)是基于各因素間無交互影響時(shí)，以優(yōu)選因素主效應(yīng)而進(jìn)行的多因素高、低兩個(gè)水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要用于因素較多且未確定的因素對(duì)于響應(yīng)變量有顯著性影響的情況。但該試驗(yàn)設(shè)計(jì)不能區(qū)分主效應(yīng)與交互作用的影響，僅能確定具有顯著性影響的因素[14]。本研究通過Plackett-Burman試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比是影響水石榴中總黃酮含量的顯著性因素。隨后進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)以確定這兩個(gè)因素的正、負(fù)效應(yīng)，正效應(yīng)即當(dāng)增大因素水平時(shí)，總黃酮含量由低變高，反之則為負(fù)效應(yīng)。通過設(shè)計(jì)合理的步長(zhǎng)、增加試驗(yàn)的密集度，以逼近總黃酮含量最高值，確定2個(gè)顯著性因素的最佳取值范圍。

Box-Behnken響應(yīng)面的擬合方程僅在考察指標(biāo)緊接區(qū)域范圍時(shí)才能充分反映近似真實(shí)情形，在其他區(qū)域的擬合方程與近似函數(shù)方程幾乎無相似之處，意義不大[15]。因此，本研究在Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法，對(duì)水石榴中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可提高試驗(yàn)的精度和預(yù)測(cè)性[16]。

在測(cè)定總黃酮含量時(shí)，本課題組曾嘗試以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色體系進(jìn)行顯色，并在400～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液在500 nm波長(zhǎng)處沒有特征吸收。隨后改用以三氯化鋁法顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液在406 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且與對(duì)照品在410 nm波長(zhǎng)處的吸收峰接近，故本研究采用三氯化鋁法顯色。進(jìn)一步對(duì)顯色條件進(jìn)行優(yōu)化，如取供試品溶液0.3 mL，分別考察加入不同劑量顯色劑（2、3、4、5、6 mL）、顯色時(shí)間（5、10、15、20、25 min）、顯色溫度（25、35、45、55、65 ℃）時(shí)的吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)顯色劑劑量為5 mL、顯色時(shí)間為20 min、顯色溫度為45 ℃時(shí)的吸光度最高。

本研究所得最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶ 34（g/mL），提取次數(shù)3次，提取時(shí)間60 min，提取溫度80 ℃。在此條件下，水石榴中總黃酮含量為2.71%。

綜上所述，本研究所建含量測(cè)定方法穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可用于測(cè)定水石榴中總黃酮的含量;優(yōu)化所得提取工藝穩(wěn)定、可行。

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（收稿日期：2019-04-02 修回日期：2019-08-22）

（編輯：陳 宏）