于彩云　趙晨　黃芳　宋愛(ài)榮

[摘要]目的通過(guò)檢測(cè)桑黃3種提取物對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤率，探討桑黃提取物的抗腫瘤活性。方法將SPF級(jí)昆明種小鼠隨機(jī)分組后，于小鼠右前肢腋窩皮下接種H22肝癌細(xì)胞，接種1 d后，分別采用桑黃3種提取物的低、中、高劑量（100、500、1 000 mg·kg-1·d-1）灌胃，以生理鹽水和環(huán)磷酰胺為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，連續(xù)給藥10 d。實(shí)驗(yàn)期間每天測(cè)定各組小鼠的體質(zhì)量;給藥10 d后處死小鼠測(cè)瘤質(zhì)量，并計(jì)算各組抑瘤率。結(jié)果桑黃3種提取物可以增加H22荷瘤小鼠體質(zhì)量。低、中、高劑量桑黃菌絲體多糖提取物對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤率分別為32.87%、57.08%和68.35%;低、中、高劑量桑黃子實(shí)體多糖提取物對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤率分別為44.14%、52.81%和73.69%;低、中、高劑量桑黃發(fā)酵液多糖提取物對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤率分別為49.16%、50.63%和51.81%。結(jié)論桑黃3種提取物均具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其中抗腫瘤效果最好的是桑黃子實(shí)體多糖提取物，該提取物也可以顯著增加H22荷瘤小鼠體質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞]桑黃;中草藥;肝腫瘤;抗腫瘤藥

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the antitumor activity of Phellinus igniarius extracts by analyzing the tumor inhibition rate of three Phellinus igniarius extracts in H22 tumor`-bearing mice. MethodsSpecific pathogen`-free Kunming mice were randomly divided into groups and then inoculated with H22 hepatoma cells under the axilla of the right forelimb. On day 1 after inoculation， three Phellinus igniarius extracts were administered by gavage at a low dose of 100 mg·kg-1·d-1， a middle dose of 500 mg·kg-1·d-1， and a high dose of 1 000 mg·kg-1·d-1; the mice in the negative control group were given normal saline， and those in the positive control group were given cyclophosphamide. The course of treatment was 10 consecutive days for all groups. Body weight was measured every day， and after 10 d of administration， the mice were sacrificed to measure tumor weight， and tumor inhibition rate was calculated for all groups. ResultsThese three Phellinus igniarius extracts increased the body weight of H22 tumor`-bearing mice. The low`-， middle`-， and high`-dose mycelia polysaccharides from Phellinus igniarius had a tumor inhibition rate of 32.87%， 57.08%， and 68.35%， respectively; the low`-， middle`-， and high`-dose fruit body polysaccharides from Phellinus igniarius had a tumor inhibition rate of 44.14%， 52.81%， and 73.69%， respectively; the low`-， middle`-， and high`-dose Phellinus igniarius polysaccharides extracted from fermentation broth had a tumor inhibition rate of 49.16%， 50.63%， and 51.81%， respectively. ConclusionAll three Phellinus igniarius extracts have a strong antitumor activity， among which fruit body polysaccharides from Phellinus igniarius have the best antitumor effect and can significantly increase the body weight of H22 tumor`-bearing mice.

[KEY WORDS]Phellinus igniarius; drugs， Chinese herbal; liver neoplasms; antineoplastic agents

桑黃為擔(dān)子菌門(mén)、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科的藥用真菌[1`-3]。該菌在我國(guó)中南地區(qū)通常生長(zhǎng)在桑屬植物上，因其子實(shí)體為黃褐色而得名[4`-5]。中國(guó)目前發(fā)現(xiàn)的桑黃類(lèi)群有7種，只有生長(zhǎng)在桑樹(shù)上的才是真正的桑黃[6]。桑黃作為一種傳統(tǒng)中藥在東亞國(guó)家已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[7]。桑黃味微苦，能利五臟、軟堅(jiān)、排毒、止血、活血、活胃止瀉，民間用于治療淋病、崩漏帶下等[8`-10]。桑黃是目前國(guó)際公認(rèn)的抗腫瘤效果最好的大型真菌之一[11`-13]。桑黃多糖是桑黃主要的活性成分，可以從桑黃子實(shí)體、菌絲體和發(fā)酵液中提取。目前比較桑黃不同提取物體內(nèi)抗腫瘤作用的研究少見(jiàn)。本研究擬通過(guò)比較桑黃3種提取物對(duì)H22荷瘤小鼠的抑制率，探討其抗腫瘤活性差異，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用桑黃提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1樣品桑黃菌絲體多糖提取物、桑黃子實(shí)體多糖提取物、桑黃發(fā)酵液多糖提取物均由山東應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。將不同多糖提取物溶于蒸餾水制備小鼠灌胃樣品。

1.1.2動(dòng)物及瘤株SPF級(jí)昆明種小鼠由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量（19±2）g，雌雄各半;荷肝癌H22瘤株小鼠由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3儀器及耗材實(shí)驗(yàn)所用的儀器及耗材如下：顯微鏡，百分之一、萬(wàn)分之一天平，培養(yǎng)皿，一次性使用無(wú)菌注射器，小燒杯，量筒，滴管，吸耳球，玻璃棒，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，蓋玻片，載玻片，膠皮手套，脫脂棉，手術(shù)刀，解剖剪，鑷子。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組及稱(chēng)體質(zhì)量將66只小鼠隨機(jī)裝入11個(gè)籠子中，每籠6只，雌雄各半。取9籠小鼠平均分為3組，每組用一種桑黃提取物灌胃，每組3籠小鼠分別設(shè)為低劑量組（100 mg·kg-1·d-1）、中劑量組（500 mg·kg-1·d-1）和高劑量組（1 000 mg·kg-1·d-1）;剩余的2籠小鼠分別設(shè)為生理鹽水組（陰性對(duì)照）和環(huán)磷酰胺組（陽(yáng)性對(duì)照，給予環(huán)磷酰胺20 mg·kg-1·d-1）。每天稱(chēng)籠中6只小鼠體質(zhì)量，并分別計(jì)算每組小鼠的平均體質(zhì)量。

1.2.2肝癌細(xì)胞采集及計(jì)數(shù)用脫脂棉蘸乙醇擦拭H22種鼠腹部，以一次性注射器無(wú)菌采集其腹水，用生理鹽水稀釋后，取少量在顯微鏡下計(jì)數(shù)，使肝癌細(xì)胞密度達(dá)到2×109/L。肝癌細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：將潔凈的帶有蓋玻片的計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下，找到視野，用滴管吸取少許瘤細(xì)胞稀釋液從計(jì)數(shù)板一側(cè)注入，使液體沿兩玻片間滲入，勿使菌液流到蓋玻片或兩邊平臺(tái)上，多余的液體用吸水紙吸去，稍待片刻，先置低倍鏡下觀察，找到中央平臺(tái)的方格網(wǎng)后，轉(zhuǎn)換高倍鏡取左上、右上、左下、右下及中央的中格進(jìn)行計(jì)數(shù)。每毫升稀釋液中肝癌細(xì)胞數(shù)=每小格平均細(xì)胞數(shù)×400×1 000×稀釋倍數(shù)。

1.2.3接種將稀釋并細(xì)胞計(jì)數(shù)后的腹水分別接種于66只小鼠右前肢腋窩皮下，每只接種0.2 mL。

1.2.4灌胃給藥小鼠接種1 d后開(kāi)始灌胃給藥，每天每只定時(shí)灌胃給藥0.2 mL，連續(xù)給藥10 d。灌胃藥現(xiàn)配現(xiàn)灌，以保持最佳藥效。

1.2.5計(jì)算抑瘤率給藥10 d后小鼠稱(chēng)質(zhì)量后處死，剖取肝腫瘤組織，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（生理鹽水組平均瘤質(zhì)量-樣品組平均瘤質(zhì)量）/生理鹽水組平均瘤質(zhì)量×100%。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1不同劑量桑黃菌絲體多糖提取物對(duì)H22荷瘤小鼠的作用

2.1.1對(duì)體質(zhì)量的影響桑黃菌絲體多糖提取物低劑量組小鼠體質(zhì)量在前3 d比較穩(wěn)定，第4、5天雖有降低，但是從第6天開(kāi)始體質(zhì)量增加，第7天達(dá)到峰值;中劑量組小鼠體質(zhì)量前4 d比較穩(wěn)定，從第5天開(kāi)始體質(zhì)量急劇增加，第7天達(dá)到峰值;高劑量組小鼠體質(zhì)量總體上逐漸增加，只是增量較小，比較穩(wěn)定;生理鹽水組小鼠的體質(zhì)量總體上呈緩慢降低的趨勢(shì);環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量在前4 d很穩(wěn)定，從第5天開(kāi)始急劇下降，第10天降至最低。各組間體質(zhì)量比較，僅環(huán)磷酰胺組在第6～10天時(shí)較生理鹽水組顯著下降（F=33.31～101.03，P<0.05、0.01），其他組差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。見(jiàn)圖1。

2.1.2對(duì)腫瘤的抑制作用環(huán)磷酰胺組和桑黃菌絲體多糖提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組的抑瘤率分別為（71.03±1.71）%、（32.87±6.25）%、（57.08±4.50）%和（68.35±2.50）%。桑黃菌絲體多糖提取物低劑量組和中劑量組的抑瘤率顯著低于環(huán)磷酰胺組（F=214.91，P<0.01），而桑黃菌絲體多糖提取物高劑量組的抑瘤率與環(huán)磷酰胺組相比差異無(wú)顯著性（P>0.05）。桑黃菌絲體多糖提取物對(duì)腫瘤的抑制作用呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，以高劑量組的抑瘤作用最強(qiáng)。不同劑量桑黃菌絲體多糖提取物的抑瘤率均大于30%，符合國(guó)家中醫(yī)藥管理局制定的治療惡性腫瘤中藥的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2不同劑量桑黃子實(shí)體多糖提取物對(duì)H22荷瘤小鼠的作用

2.2.1對(duì)體質(zhì)量的影響桑黃子實(shí)體多糖提取物低劑量組小鼠體質(zhì)量總體上呈緩慢增加的趨勢(shì);中劑量組小鼠體質(zhì)量在前4 d比較穩(wěn)定，從第5天開(kāi)始突然增加，第8天達(dá)到峰值;高劑量組小鼠體質(zhì)量在前5 d比較穩(wěn)定，從第6天開(kāi)始增加，第8天達(dá)到峰值。桑黃子實(shí)體多糖提取物不同劑量組小鼠體質(zhì)量均有所增加，但是增加量與劑量不呈量效關(guān)系，以中劑量組小鼠體質(zhì)量增加最多。在第3～10天時(shí)，與生理鹽水組相比，高劑量組、中劑量組小鼠體質(zhì)量增加，環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量降低，差異均有顯著性（F=22.01～149.25，P<0.05、0.01）。見(jiàn)圖2。

2.2.2對(duì)腫瘤的抑制作用桑黃子實(shí)體多糖提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組的抑瘤率分別為（44.19±4.81）%、（52.81±4.20）%和（73.69±2.00）%，低劑量組和中劑量組的抑瘤率顯著低于環(huán)磷酰胺組（F=232.33，P<0.01），而高劑量組的抑瘤率與環(huán)磷酰胺組相比差異無(wú)顯著性（P>0.05）。桑黃子實(shí)體多糖提取物對(duì)腫瘤的抑制作用呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，以高劑量組的抑瘤作用最強(qiáng)。

2.3不同劑量桑黃發(fā)酵液多糖提取物對(duì)H22荷瘤小鼠的作用

2.3.1對(duì)體質(zhì)量的影響桑黃發(fā)酵液多糖提取物低劑量組小鼠體質(zhì)量總體上呈緩慢增加的趨勢(shì);中劑量組小鼠體質(zhì)量于第3天達(dá)到峰值，之后維持相對(duì)穩(wěn)定;高劑量組小鼠體質(zhì)量持續(xù)上升，于第10天達(dá)到峰值。桑黃發(fā)酵液多糖提取物增加小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)關(guān)系，以高劑量組小鼠體質(zhì)量增加最多。各組間體質(zhì)量比較，環(huán)磷酰胺組在第5～10天時(shí)較生理鹽水組下降，高劑量組在第7～10天時(shí)較生理鹽水組升高，中劑量組和低劑量組在第10天時(shí)較生理鹽水組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.25～169.05，P<0.05、0.01）。見(jiàn)圖3。

2.3.2對(duì)腫瘤的抑制作用桑黃發(fā)酵液多糖提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組的抑瘤率分別為（49.16±4.50）%、（50.63±4.21）%和（51.81±2.90）%，均顯著低于環(huán)磷酰胺組（F=119.80，P<0.01），但桑黃發(fā)酵液多糖提取物不同劑量組間比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。不同劑量桑黃發(fā)酵液多糖提取物的抑瘤率均大于30%，符合國(guó)家中醫(yī)藥管理局制定的治療惡性腫瘤中藥的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

3討論

大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，桑黃對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用[14`-16]。桑黃可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖[17`-19]、增強(qiáng)NK細(xì)胞活性[20]、緩解炎癥[21]，在抗氧化[22`-24]、清除自由基[25`-26]、抗肌纖維化[27`-28]、降低血糖[29]方面也有一定的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑黃3種提取物不同劑量均具有明顯抑制H22肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其抑瘤率均大于30%，符合國(guó)家中醫(yī)藥管理局制定的治療惡性腫瘤中藥的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠連續(xù)14 d以500 mg/kg劑量灌胃給予桑黃多糖，對(duì)移植性胃癌的抑制率為43.09%，對(duì)肉瘤S180的抑制率為46.07%[30]。

在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，對(duì)于同種桑黃提取物來(lái)說(shuō)，抗腫瘤作用強(qiáng)度與劑量呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，而相同劑量的不同提取物的抗腫瘤效果不同，提示桑黃3種提取物中多糖的種類(lèi)和含量有差別。應(yīng)瑞峰等[31]的研究結(jié)果表明，桑黃子實(shí)體多糖抗腫瘤效果（抑瘤率50%～80%）顯著高于桑黃菌絲體多糖（抑瘤率20%～70%）。本研究中，抗腫瘤作用最強(qiáng)的是桑黃子實(shí)體多糖提取物的高劑量組，其抑瘤率為73.69%，與應(yīng)瑞峰等[31]的研究結(jié)果相似。環(huán)磷酰胺雖然對(duì)肝癌的抑制效果好，但是由于其對(duì)小鼠的殺傷和毒副作用，降低了小鼠的免疫力。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用桑黃多糖提取物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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