楊曉偉 張銀環(huán) 段飛鵬 肖紅斌

摘要? 目的：探索連續(xù)4周服用大黃素對大鼠肝組織蛋白表達的影響。方法：選取以大黃折算臨床劑量100倍的大黃素灌胃SD大鼠4周（HG1，HG2，HG3，HG4）為模型，采用Lable-free蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測肝組織蛋白表達，并對所得結(jié)果進行分析。結(jié)果：通過篩選，HG1、HG2、HG3、HG4組中分別有158個、650個、219個、378個差異蛋白，這些差異蛋白經(jīng)GO分析發(fā)現(xiàn)主要與細胞和代謝過程相關(guān)。其中，4組中共有差異蛋白25個，GO分類表明25個蛋白中有10個為與催化活性相關(guān)的蛋白。大黃素的存在使α-2-HS-糖蛋白（熱穩(wěn)定性糖蛋白）表達上調(diào)，該蛋白的濃度與肝病的嚴重程度正相關(guān);并且組織蛋白酶家族蛋—富含半胱氨酸的蛋白酶表達下調(diào)。結(jié)論：長期服用大黃素會增加肝損傷的概率，其可能是由于含半胱氨酸蛋白酶的表達下調(diào)，使組織功能出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致肝損傷的出現(xiàn)，并且這一結(jié)果在低劑量組中也得到了印證。

關(guān)鍵詞? 大黃素;蛋白質(zhì)組學(xué);肝損傷;組織蛋白酶;機制;半胱氨酸

Study on Mechanism of Liver Injury in Rats Induced by Emodin Based on Lable-free Proteomics Technology

Yang Xiaowei1， Zhang Yinhuan2， Duan Feipeng2， Xiao Hongbin2

（1 Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China; 2 Research Center for Chinese Medicine Analysis and Transformation， Beijing University of Chinese Medicine.， Beijing 100029， China）

Abstract Objective： To investigate the influence of 4-week′s emodin on protein expression of rat′s liver tissue.? Methods： SD rats were given emodin 100 times more than the clinical dose of Rhubarb for 4 weeks and were divided into four groups （HG1，HG2，HG3，HG4）. Protein expression in liver tissue was detected by lable-free proteomic technology.? Results： By screening， there were 158， 650， 219， and 378 differential proteins in HG1， HG2， HG3， and HG4 group respectively， which were found to be mainly associated with cellular and metabolic processes by GO analysis. Among them， there were 25 differential proteins in the four groups， and GO classification indicated that 10 of the 25 proteins were proteins related to catalytic activity. α-2-HS-glycoprotein （thermostable glycoprotein） expression was upregulated by the presence of emodin， and the concentration of this protein positively correlated with the severity of liver disease; and cathepsin family egg-cysteine-rich protease expression was downregulated.? Conclusion： Long-term administration of emodin increases the probability of liver injury， which may be due to the down-regulation of the expression of cysteine-containing proteases， which leads to the disorder of tissue function and leads to the appearance of liver injury， and this result has also been confirmed in the low-dose group.

Key Words? Emodin; Protiomics; Liver injury; Cathepsin; Mechanism; Cysteine

中圖分類號：R284;R575 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.014

大黃素是一種蒽醌類衍生物，主要來源于蓼科植物掌葉大黃根莖，其化學(xué)名稱為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌（1，3，8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone），是中藥大黃、何首烏、決明子等的主要有效單體物質(zhì)。長期以來，大黃素被中醫(yī)學(xué)認為其主要具有瀉下、抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制、保肝、抗腎纖維化等藥理作用[1-6]。然而，近年來對于大黃蒽醌致肝損傷的報道層出不窮，發(fā)現(xiàn)大黃素在5種蒽醌中含量是相對較高的，且美國國家衛(wèi)生研究院對大黃素的長期藥用的毒性進行了詳細的闡述并表明長期服用大黃素會導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)肝損傷[7];何首烏95%乙醇洗脫物是引起其肝損傷的主要物質(zhì)，而大黃素是導(dǎo)致肝細胞損傷的成分之一[8]。何首烏主要有效成分大黃素、大黃酸和二苯乙烯苷在不同濃度下不同作用時間對肝細胞L-02和BEL肝癌細胞影響的研究認為蒽醌類成分大黃素和大黃酸是何首烏肝臟不良反應(yīng)的主要成分[9]。大黃素作為常用中草藥的有效成分，使用頻率之高使得我們對其安全性問題格外重視，但是目前對大黃素肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不清楚，這嚴重制約了含有該成分的藥物的臨床應(yīng)用，因此進行相關(guān)的研究是十分有必要的。

本研究是基于課題組之前的研究結(jié)果[10]，運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究高劑量（1500 mg/kg相當于大黃臨床等效劑量的100倍）的大黃素在不同時間點（HG1，給藥1周;HG2，給藥2周;HG3，給藥3周;HG4，給藥4周）對大鼠肝臟的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，9周齡，體質(zhì)量（200±10）g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，恒溫，恒濕，自由飲水，普通飼料。

1.1.2 藥物

大黃素，購自成都瑞芬思生物科技有限公司，CAS號：518-82-1，純度≥98%。

1.1.3 試劑與儀器

主要試劑：十二烷基磺酸鈉（SDS，美國，Amresco，貨號：151-21-3）;蛋白酶抑制劑（PMSF，瑞士，Sigma，貨號：P8340-1ML）;胰蛋白酶（Trypsin Gold，美國，Promega，貨號：V5280）、乙腈（Acetonitrile，CAN，美國，Thermo fisher，貨號：A998-4;BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，貨號：P0012）。

主要儀器：NE-C900型壓縮式霧化器（OMRON，NE-C900）、自制霧化箱（60 cm×50 cm×40 cm）、冷凍離心機（Eppendorf，5810）、真空冷凍干燥機（Thermo savant，ModulyoD-230）、Easy-nLC 1000系統(tǒng)（Thermo Scientific）、分析型液相色譜Agilent 1200（Agilent，1200）、Q Exactive系統(tǒng)（Thermo Scientific）、Protein Pilot 5.0軟件（AB SCIEX）。

1.2 方法

1.2.1 樣本選擇

本研究以課題組前期研究為基礎(chǔ)，意圖利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析在不同時間點時，高劑量與空白對照組之間的差異，利用前期采集的樣本，進一步闡述大黃素致肝損傷的作用機制。

1.2.2 蛋白提取及酶解

100 mg肝組織樣本，加入500 μL細胞和組織裂解液和5 μL蛋白酶抑制劑（PMSF），低溫勻漿、超聲破碎。溶液4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清，去除不容性雜質(zhì)。上清液即為組織的總蛋白溶液，采用BCA測定提取的蛋白濃度并分裝后儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取20 μL等濃度樣本，做十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE），用考馬斯亮藍染色后，將凝膠膠置于玻璃皿中，切下條帶，然后將膠條帶切成小塊;加入蒸餾水潤洗2遍;加入適量的脫色液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，脫色30 min;吸去脫色液，加入適量的純ACN潤洗，吸去ACN，再加入ACN，放置10 min，吸出ACN，用真空離心濃縮儀脫水使膠塊干燥;向干燥的膠塊中加入25 mmol/L DTT溶液，置于空氣加熱器中，55 ℃，45 min;加適量ACN潤洗，后吸干，再加ACN，10 min，吸去ACN，真空濃縮脫水;加入適量的55 mmol/LIAA（Iodoacetamide）溶液，避光30 min;ACN潤洗，后用ACN浸泡10 min，冷凍干燥脫水;加胰蛋白酶，將膠粒沒過，倒置于37 ℃恒溫箱中，12～16 h;用1 μL的10% TFA溶液終止酶解反應(yīng)，10×g離心，是膠粒和溶液分開，吸出溶液，置于一個新的離心管中;加入沒過膠粒的萃取液（50%ACN，0.1% FA），37 ℃，30 min，取上清液與之前的上清液合并。此步驟重復(fù)2次;將上清液放在真空離心濃縮儀中濃縮，剩1～2 μL的時候取出離心管，加入20 μL的0.1% FA溶液復(fù)溶，振蕩混勻后離心，重復(fù)2次;將溶液加入質(zhì)譜上樣瓶中，進質(zhì)譜檢測。

上述實驗進行3次獨立的生物學(xué)重復(fù)（即將每組的12個肺組織，均勻混樣為3個樣品，分別進行獨立實驗）。

1.2.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

1.2.3.1 反向液相色譜分離

將制備好的樣本用Thermo-Dionex終極3000高效液相色譜系統(tǒng)進行分離，梯度洗脫60 min，流速0.25 μL/min，這是直接干擾熱LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜儀。分析柱是自制的熔融石英毛細管柱（75 μm ID，150毫米長度;C-18（300A，5 μm;Varian，Lexington，MA）。流動相A由0.1%甲酸水組成，流動相B由乙腈和0.1%甲酸組成。

1.2.3.2 質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜采用LTQ-Orbitrap系統(tǒng)（Thermo Scientific），納升噴霧離子源，噴霧電壓為1.6 kV，毛細管溫度為250 ℃，質(zhì)譜掃描方式為數(shù)據(jù)依賴的采集工作模式下（DDA，Data Dependent Analysis），每次全掃描后最多采集20個碎片圖譜。全掃描分辨力：70 000;MS/MS分辨力：30 000;母離子掃描范圍：400～1 800 m/z;碰撞能量：35% CID。

1.2.4 Western blotting驗證試驗

Western blot試驗利用目的蛋白的抗體作為一抗，HRP-IgG作為二抗。肝組織中的蛋白通過SDS-PAGE進行初步分離后，轉(zhuǎn)移到0.45 μm的硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜過程在低溫下完成。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的蛋白用濃度為5%的脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，封閉液為脫脂奶粉溶于含有150 mmol/L NaCl、0.2% Tween 20和0.05% Triton X-100的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）（TBST）。在封閉之后的硝酸纖維素膜用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中，目的蛋白與其一抗進行孵育，室溫下2 h。徹底清洗硝酸纖維素膜后，在室溫下用HSP-IgG（1：5 000溶于含有5%脫脂奶粉的TBST中）孵育2 h。結(jié)合的抗體通過Super Signal West Pico Trial Kit的化學(xué)發(fā)光法進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

1.3.1 蛋白鑒定及差異蛋白篩選

將通過實驗得到的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫模擬得到的理論質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行匹配，從而得到蛋白質(zhì)鑒定的原始結(jié)果。數(shù)據(jù)處理采用含Paragon algorithm算法的Protein Pilot Software v.5.0（AB SCIEX，USA）軟件進行，本次實驗使用的數(shù)據(jù)庫為大鼠數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫來源于Uniprot?；诘鞍踪|(zhì)鑒定的原始結(jié)果進行分析篩選得到可信蛋白?？尚诺鞍缀Y選標準：Peptide≥1。

基于可信蛋白進行顯著差異表達蛋白的篩選。差異蛋白篩選標準：首先將3次實驗的可信蛋白數(shù)據(jù)進行合并，利用v-lookup函數(shù)，將3次實驗中相同ID的蛋白合并到一起。然后利用組內(nèi)比較設(shè)置矩陣數(shù)組，最后利用t-test算法計算出模型組與空白對照組的差異變化倍數(shù)FC以及差異顯著性值 P ，采用 P <0.05，且FC變化為1.5倍進行差異蛋白篩選（即FC>1.5或FC<0.67）。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

基因本體論（Gene Ontology，GO）是基因本體聯(lián)合會（Gene Ontology Consortium）建立的數(shù)據(jù)庫，可以用一套具有動態(tài)形式的控制字集（Controlled Vocabulary），來描述基因及蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)所扮演的角色，從而來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。本實驗采用Panther和Davide（http：//www.pantherdb.org/和https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對篩選的差異表達蛋白質(zhì)進行GO分類注釋和富集分析。

蛋白互作基于String數(shù)據(jù)庫進行分析，string數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)間預(yù)測的功能相關(guān)性的一個數(shù)據(jù)庫，可以搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)。這種相互作用既包括蛋白質(zhì)之間的物理相互作用，也包括蛋白質(zhì)之間的功能相關(guān)性。利用蛋白之間的相互作用關(guān)系，可以推測其作用方式及機制。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白篩選及GO富集

以 P <0.05，F(xiàn)C變化倍數(shù)大于1.5為標準篩選各組間差異蛋白。與空白組比較，HG1組中有158種蛋白的表達有差異，HG2組中由650個差異蛋白，HG3中有219個差異蛋白，HG4中有378個差異蛋白。通過Panther軟件分析，發(fā)現(xiàn)各組中的差異蛋白均主要參與代謝過程和細胞過程（圖1）。

利用4組中的差異蛋白做韋恩圖（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)有25個蛋白是在4組中都存在的（表1）。隨著時間的推移，大黃素對肝組織的破壞作用是逐步 加重的，貫穿在4周中一直發(fā)生變化的蛋白是與大黃素的破壞作用直接相關(guān)的，在25個共有差異蛋白中，有21個蛋白在4組中均表達上調(diào)，4個蛋白在4組中均表達下調(diào)。

2.2 25個差異蛋白功能聚類分析

通過Panther軟件的蛋白功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，25個蛋白中有10個蛋白是有催化活性，2個有抗氧化活性，3個與蛋白連接相關(guān)（圖3），且有9個蛋白表達上調(diào)（表2），說明這9個蛋白與大黃素導(dǎo)致的肝損傷極為相關(guān)：3個為蛋白酶體蛋白以及1個熱休克蛋白70家族蛋白高表達;另外，α-2-HS-糖蛋白（熱穩(wěn)定性糖蛋白）在4組中的表達量均為上調(diào)。此外，10個蛋白中有1個蛋白：組織蛋白酶S，該酶為半胱氨酸蛋白酶家族成員，富含半胱氨酸，而大黃素的存在影響了含半胱氨酸蛋白的正常表達，使組織蛋白酶S的功能不能正常發(fā)揮。

由圖4可見，25個相關(guān)蛋白主要可以分為兩部分，一部分是與蛋白酶體相關(guān)的蛋白，主要是用來水解錯誤折疊的蛋白質(zhì);另一部分是HSP70相關(guān)通路。

2.3 Western blotting（WB）驗證試驗

蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示，大黃素的存在使α-2-HS-糖蛋白（熱穩(wěn)定性糖蛋白）和HSP70表達上調(diào)，而與空白對照組相比組織蛋白酶S在各組中均為下調(diào)。結(jié)果如圖5所示，隨著時間的延長，各個蛋白的表達量與組學(xué)數(shù)據(jù)一致。并且無論是在高劑量組還是在低劑量組，組織蛋白酶都有表達下調(diào)的趨勢（圖6）。

3 討論

黃素在體外有良好的藥理活性，如抗氧化[11-13]，抗炎[14-15]，抗血管生成[16-17]，誘導(dǎo)細胞凋亡[18-20]，但由于對大黃素體內(nèi)代謝缺乏詳細了解，大黃素的作用機制仍然是一個未解的問題。因此，為了清楚大黃素在體內(nèi)與哪些蛋白有相互關(guān)系，是否安全，我們設(shè)計了一系列實驗。前期研究發(fā)現(xiàn)，灌胃高劑量的大黃素時，大鼠肝組織切片內(nèi)部會有炎性反應(yīng)出現(xiàn)，并且隨著時間的延長而加重，最終在第四周時出現(xiàn)脂肪空泡。HG1（第1周）組與空白對照組比較，有158個差異蛋白。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，大黃素使肝細胞中的質(zhì)子傳輸受到影響，進而影響能量代謝，并且這一影響也在低劑量組中也同樣存在。既然灌胃高劑量大黃素1周時，肝組織蛋白變化明顯，那么隨著時間的推移，大黃素的影響是否會加??？導(dǎo)致肝損傷出現(xiàn)的原因是什么？

本試驗通過對高劑量給藥4周4個時間點的大鼠肝組織做蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，25個差異蛋白是在4組差異蛋白中共同存在的，21個蛋白在4組中均表達上調(diào)，4個蛋白在4組中均表達下調(diào)。蛋白酶體蛋白亞基及熱休克蛋白70家族表達上調(diào)，蛋白酶體蛋白與熱休克蛋白70家族均與蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，試驗結(jié)果說明蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)錯誤概率增加，使一些蛋白質(zhì)合成功能的出現(xiàn)紊亂。在催化活性的蛋白當中，α2-HS-糖蛋白（熱穩(wěn)定性糖蛋白），該蛋白的含量可以在一定程度上指示肝病的發(fā)展狀況，是一個新型的肝病早期預(yù)測指標[21]。本實驗中，4組中該蛋白表達量均為上調(diào)，說明隨著時間的推移肝組織受到了一定程度的破壞，也進一步說明大黃素的長期用藥可以導(dǎo)致肝損傷。此外，10個催化活性蛋白中有1個蛋白：組織蛋白酶S表達下調(diào)，該酶為半胱氨酸蛋白酶家族成員，富含半胱氨酸，該酶的下調(diào)可能是因為大黃素與半胱氨酸的加合反應(yīng)導(dǎo)致合成蛋白的原料耗竭，無法正常合成該酶，這與文獻報道結(jié)果相一致[22]。并且這一結(jié)果在WB數(shù)據(jù)中也得到了證實：無論高劑量還是低劑量，大黃素都能引起含半胱氨酸的組織蛋白酶表達下調(diào)，這也說明長期服用大黃素會增加肝損傷的概率，不建議長期大劑量服用。

長期服用大黃素會導(dǎo)致大鼠肝組織出現(xiàn)炎性反應(yīng)，有引起肝損傷的風險。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，大黃素可以使組織蛋白酶家族中的幾個重要酶表達下調(diào)，影響正常的肝組織功能。并且無論是在高劑量組還是在低劑量組，這種影響都是存在的。

致謝：

楊曉偉負責實驗的設(shè)計、實施和論文的撰寫;張銀環(huán)、段飛鵬負責部分實驗數(shù)據(jù)的整理;肖紅斌為本實驗提供了思路及指導(dǎo)。

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