蔡智超 吳清來 方守國(guó)

摘要：申嗪霉素及其衍生物具有抑菌和抗癌活性。該文檢測(cè)了17種申嗪酰胺類衍生物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性和9種該類衍生物禽傳染性支氣管炎病毒（ IBV）復(fù)制的影響。結(jié)果表明，濃度為10μg/mL時(shí)，9種衍生物SQXA-O1、02、06、08、09、11、12、14、16對(duì)Vero細(xì)胞無毒性，而其他8種衍生物均產(chǎn)生不同程度的毒性;在最大無毒濃度下，SQXA-02、06和16在2種處理方式下均具有較高的抗IBV活性，而SQXA-O1、08、09、11、12在B方式處理下具有較高的抗IBV活性（相對(duì)抑制率>80%），而在A方式處理下活性較低。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究衍生物抗病毒的機(jī)制和藥物研發(fā)提供了理論支持。

關(guān)鍵詞：申嗪酰胺類衍生物;禽傳染性支氣管炎病毒;細(xì)胞毒性;抑制作用

中圖分類號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi：10.3969/j .issn.2096-3637.201 9.10.001

0 引言

申嗪霉素又名吩嗪-1-羧酸（PCA），最早在染料合成中被發(fā)現(xiàn)[1]。19世紀(jì)50年代科學(xué)家從鏈霉菌（Streptomyceschromogenus sp.）和極毛桿菌（Pseudomonads fluorescens）的代謝物中分離提取到吩嗪-l-羧酸[2]。許煜泉等從假單胞菌株M18（ Pseudomonas sp.）的分泌物中發(fā)現(xiàn)了具有強(qiáng)烈農(nóng)用抑菌活性的物質(zhì)，結(jié)構(gòu)鑒定為吩嗪-l-羧酸，研究發(fā)現(xiàn)其具有廣譜性農(nóng)用抗菌活性[3-4]。在某些癌細(xì)胞中，吩嗪-1-羧酸同樣表現(xiàn)出抑制生長(zhǎng)的效果[5]，但對(duì)于正常細(xì)胞則表現(xiàn)為低毒性[6]。在影響病毒復(fù)制方面，還未見詳細(xì)報(bào)道。本研究檢測(cè)了17種申嗪酰胺類衍生物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性以及其中9種衍生物對(duì)IBV病毒復(fù)制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

17種申嗪酰胺類衍生物均由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)藥研究所提供，見表l。非洲綠猴腎細(xì)胞系（ Vero）和表達(dá)熒光素酶的禽傳染性支氣管炎病毒（IBV-3ab-Iuc）[7]由本實(shí)驗(yàn)室保存。高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25% Trypsin-EDTA、FBS購于Gibco、MTT購于Solarbio。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2 1 申嗪酰胺類衍生物對(duì)Vero細(xì)胞的最大無毒濃度的測(cè)定

DMSO溶解17種申嗪酰胺類衍生物，見表1，使其濃度為10 mg/mL，超聲波震蕩1 min，使化合物充分溶解，常溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

將復(fù)蘇后傳代3次的Vero細(xì)胞從T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔約接種細(xì)胞5 x 10⁴個(gè)，37℃環(huán)境下5% C02恒溫培養(yǎng)至長(zhǎng)滿板底50%時(shí)加入化合物，每種化合物設(shè)置3種濃度：100、50、10μg/mL，及1個(gè)DMSO對(duì)照組，3次重復(fù)，37℃環(huán)境下5% C02恒溫培養(yǎng)至對(duì)照組細(xì)胞鏡檢下長(zhǎng)滿板底時(shí)停止處理。真空泵吸干每孔中的上清液，用2 mL PBS小心清洗3次，每孔加入500μL 0.25%Trypsin-EDTA浸潤(rùn)10 s后吸出，室溫消化1min，加入1mL含0.1%臺(tái)盼藍(lán)的PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，倒置顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)（藍(lán)色細(xì)胞不記入其中）。

1.2.2 9種申嗪酰胺類衍生物對(duì)IBV-3ab-Iuc病毒復(fù)制的影響

將復(fù)蘇后傳代3次的Vero細(xì)胞從T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中37℃環(huán)境下5% CO2恒溫培養(yǎng)，每孔約接種細(xì)胞1×10⁴個(gè)。按照以下A、B2種加藥方式分開加藥處理，加藥濃度為其對(duì)Vero細(xì)胞的最大無毒濃度。

A加藥方式：為檢測(cè)申嗪酰胺類衍生物是否能刺激Vero細(xì)胞產(chǎn)生抗IBV作用，每種化合物設(shè)3個(gè)重復(fù)，設(shè)置1個(gè)DMSO對(duì)照組及1個(gè)空白組（不感染病毒），待Vero長(zhǎng)滿板底50%后加入9種化合物處理24 h后，吸盡培養(yǎng)液并用PBS洗2次，再加入培養(yǎng)液，而后加入IBV-3ab-luc（MOI=1.0）處理24h。

B加藥方式：為檢測(cè)申嗪酰胺類衍生物能否抑制IBV在Vero細(xì)胞中的復(fù)制，每種化合物設(shè)3個(gè)重復(fù)，設(shè)置1個(gè)DMSO對(duì)照組及1個(gè)空白組（不感染病毒）。待Vero長(zhǎng)滿板底后加入IBV-3ab-luc（MOI=1.0）處理4h，而后加入9種化合物處理20 h。

吸盡上清液，PBS小心清洗3遍，每孔加入200μLRLB常溫下浸潤(rùn)5 min，移液器吹打混勻，取50 μL RLB溶解物與50μL Luciferase Substrate混合均勻后放入單管發(fā)光檢測(cè)儀（ Promega）中檢測(cè)熒光值，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)抑制率一（1化合物處理后的熒光值/DMSO處理后的熒光值）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度申嗪酰胺類衍生物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性測(cè)定

通過調(diào)查不同濃度申嗪酰胺類衍生物處理后Vero細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)，確定衍生物對(duì)Vero細(xì)胞不產(chǎn)生毒性的濃度。結(jié)果顯示，與DMSO處理組（細(xì)胞數(shù)為1.520×10⁶個(gè)）相比，濃度為10 μg/mL時(shí)，9種衍生物SQXA-O1、02、06、08、09、11、12、14、16對(duì)Vero細(xì)胞無毒性，而其他8種衍生物均產(chǎn)生不同程度的毒性，并隨濃度的增高而漸強(qiáng);濃度為50μg/mL時(shí)，只有SQXA-01、06、14和16表現(xiàn)出無毒性;濃度為100μg/mL時(shí)，只有SQXA-Ol、14和16表現(xiàn)出無毒性。SQXA-14和16表現(xiàn)出促Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，見表2。由以上數(shù)據(jù)可得9種申嗪酰胺類衍生物在10 - 100μg/mL濃度范圍內(nèi)的最大無毒濃度：SQXA-OI（50 μg/mL）、SQXA-02（10μg/mL）、SQXA-06（ 100μg/mL）、SQXA-08（ 10μg/mL）、SQXA-09（ 100μg/mL）、SQXA-11（10 μg/mL）、SQXA-12（10μg/mL）、SQXA-14（100μg/mL）、SQXA-16（100μg/mL）。296F7240-825F-4A55-9A5D-E2361C5F476E

2.2 9種申嗪酰胺類衍生物對(duì)IBV-3ab-Iuc復(fù)制的影響

在上述9種申嗪酰胺類衍生物最大無毒濃度下，檢測(cè)其對(duì)IBV-3ab-luc復(fù)制的影響，所得的熒光值和相對(duì)抑制率見表3、表4。結(jié)果表明，方式A處理下，9種衍生物均對(duì)IBV-3ab-luc復(fù)制表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中，SQXA-02、06、14和16的相對(duì)抑制率超過50%，分別為54.5%、72.2%、60.0%和76.3%;方式B處理下，SQXA-O1、02、06、08、09、11、12、16具有較高的抗IBV-3ab-Iuc活性，相對(duì)抑制率在8 0%以上，但SQXA-14無抗病毒活性。結(jié)果顯示，SQXA-02、06和16在A、B2種處理方式下均具有較高的抗IBV活性，說明這3種化合物可直接抑制IBV的復(fù)制或通過刺激Vero細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)進(jìn)而抑制IBV的復(fù)制;SQXA-01、08、09、11、12在B方式處理下具有較高的抗IBV活性（相對(duì)抑制率>80%），而在A方式處理下活性較低（相對(duì)抑制率12.9%～42.7%），說明這5種衍生物可直接抑制IBV的復(fù)制;SQXA-14在A方式處理下具有60%的抑制IBV復(fù)制的活性，但在B方式處理下無抗病毒活性，原因不明，有待進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

申嗪霉素及其類衍生物具有良好的抗癌和抗菌活性[8-9]，但它們的抗病毒活性未見詳細(xì)報(bào)道。本文首次檢測(cè)了17種申嗪霉素酰胺類衍生物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性和IBV復(fù)制的影響。結(jié)果表明，衍生物SQXA-04、05、07、10、13、15、17、18在1Oμg/mL時(shí)對(duì)Vero細(xì)胞具有毒性，并隨著濃度的升高，對(duì)Vero細(xì)胞的毒性漸大;其他9種申嗪酰胺類衍生物在10 - 1OOμg/mL濃度范圍內(nèi)的最大無毒濃度：SQXA-01（ 50μg/mL）、SQXA-02（10μg/mL）、SQXA-06（100μg/mL）、SQXA-08（10μg/mL）、SQXA-09（100μg/mL）、SQXA-11（10μg/mL）、SQXA-12（10μg/mL）、SQXA-14（100μg/mL）、SQXA-16（ 100μg/mL）;而SQXA-14和16表現(xiàn)出促Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，說明不同的申嗪霉素酰胺類衍生物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性不同。

檢測(cè)9種申嗪酰胺類衍生物最大無毒濃度下IBV-3ab-Iuc復(fù)制的影響，結(jié)果顯示，SQXA-02、06和16在A、B2種處理方式下均具有較高的抗IBV活性，說明這3種化合物可直接抑制IBV的復(fù)制或通過刺激Vero細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)進(jìn)而抑制IBV的復(fù)制;SQXA-O1、08、09、11、12在B方式處理下具有較高的抗IBV活性（相對(duì)抑制率>80%），而在A方式處理下活性較低（相對(duì)抑制率12.9%～ 42.7%），說明這5種衍生物可直接抑制IBV的復(fù)制;SQXA-14在A方式處理下具有60%的抑制IBV復(fù)制的活性，但在B方式處理下無抗病毒活性，其抗病毒機(jī)制正處于研究中。

申嗪酰胺類衍生物分子式相同但取代基團(tuán)的連接方式或位置不同，表現(xiàn)出不同的生物活性。如SQXA-02和SQXA-05只是CI的位置不同，但SQXA-05對(duì)Vero細(xì)胞的毒性更高;SQXA-08. SQXA-15和16分子式相同但F的位置不同，SQXA-15對(duì)Vero細(xì)胞的毒性顯著高于SQXA-08，相反，SQXA-16能促進(jìn)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)，且它的抗IBV的活性高于SQXA-08; SQXA-12與SQXA-13，苯環(huán)的連接方式不同，對(duì)Vero細(xì)胞的毒性存在差異;SQXA-1O. 14和17.Cl的位置不同，SQXA-lO和17在1O - 100μg/mL濃度范圍表現(xiàn)出對(duì)Vero細(xì)胞的毒性，而SQXA-16能促進(jìn)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些作用的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目——禽傳染性支氣管炎病毒非編碼RNA的形成機(jī)制及其生物學(xué)功能（31572490）

作者簡(jiǎn)介：蔡智超（1993-），男，碩士，從事分子病毒學(xué)研究。

通信作者：方守國(guó)（1965-），男，教授，從事分子病毒學(xué)研究。296F7240-825F-4A55-9A5D-E2361C5F476E