唐小鐵 徐潔 王麗媛

摘要 目的：探討雷公藤甲素對(duì)糖尿病腎病（DN）小鼠腎足細(xì)胞自噬及調(diào)亡的影響。方法：選擇小鼠60只，隨機(jī)分為DN組和雷公藤甲素組各30只，光鏡下觀察各組腎組織病理學(xué)改變情況，觀察腎功能變化情況，對(duì)其行行威廉姆斯腫瘤蛋白1（WT-1）免疫組化染色，觀察足細(xì)胞情況，透射電鏡觀察足細(xì)胞自噬情況，采用Western blot法檢測(cè)腎組織中Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果：PAS染色結(jié)果顯示，DN組小鼠系膜基質(zhì)明顯增多，雷公藤甲素組小鼠系膜基質(zhì)明顯減少。WT-1免疫組織化學(xué)染色顯示，雷公藤甲素組腎足細(xì)胞數(shù)量比DN組明顯增多。Western Blot結(jié)果顯示，與DN組小鼠比較，雷公藤甲素組Podocin表達(dá)明顯增加，LC3-II/LC3-I比值明顯上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax及Caspase-3表達(dá)明顯減少（P<0.05）。結(jié)論：雷公藤甲素可減輕足細(xì)胞損傷，延緩DN的進(jìn)展，可DN的治療起到參考價(jià)值。

Abstract Objective：To investigate the effects of triptolide on autophagy and apoptosis of renal podocytes in diabetic nephropathy（DN）mice.Methods：A total of 60 mice were randomly divided into a DN group and a triptolide group，with 30 mice in each group.The pathological changes of kidney tissues and renal function were observed under light microscope.The the expression of podocin，Lc3，Bax and Caspase-3 in kidney tissues were detected by Western blot and immunohistochemical staining of Williams Tumor Protein-1（WT-1）and podocyte autophagy were observed under transmission electron microscope.Results：PAS staining showed that the mesangial matrix increased significantly in DN group and decreased significantly in triptolide group.WT-1 immunohistochemical staining showed that the number of renal podocytes in triptolide group was significantly higher than that in DN group.Western Blot results showed that compared with DN mice，the expression of Podocin，LC3-II/LC3-I ratio，Bax and Caspase-3 in triptolide group increased significantly，while the expression of apoptosis-related proteins decreased significantly（P<0.05）.Conclusion：Tripterygium wilfordii can alleviate podocyte injury and delay the progress of DN，which can be used as a reference for the treatment of DN.

Key Words Diabetic nephropathy; Triptolide; Sertoli cell; Podocin; Bax; Caspase-3; Lc3

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.017

糖尿?。―iabetic Mellitus，DM）是最常見(jiàn)的一種慢性疾病，隨著全球環(huán)境污染加重及居民生活飲食習(xí)慣改變，DM患病率逐年增高[1-2]。糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是DM最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，且其早期無(wú)明顯臨床狀態(tài)，易被漏診，隨著病情進(jìn)展，會(huì)出現(xiàn)腎功能不全，并最終進(jìn)展為腎功能衰竭的終末期，患者預(yù)后極差[3-4]。在DN早期及時(shí)確診，并進(jìn)行針對(duì)性的治療，可及時(shí)控制病情發(fā)展，因此預(yù)防及治療DN的發(fā)生及發(fā)展意義重大[5]。DN患者腎小球疾病病理改變時(shí)，足細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)損傷，若未及時(shí)有效治療，將誘發(fā)足細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致足細(xì)胞功能失調(diào)[6]。自噬是一種在DN發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起重要作用的防御機(jī)制，其可能是足細(xì)胞維持自身動(dòng)態(tài)平衡的重要機(jī)制[7]。雷公藤甲素是中藥雷公藤植物根的提取物，可治療多種腎小球疾病[8]。本研究通過(guò)觀察雷公藤甲素干預(yù)小鼠腎足細(xì)胞自噬及調(diào)亡情況，探討其可能的分子機(jī)制，為中醫(yī)預(yù)防及治療DN提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用8周齡雄性健康小鼠60只，均購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司[動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)：SCXK（京）2018-0009]，飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室中在（22±2）℃室溫下，保持敷料干燥，所有小鼠自由攝食飲水?dāng)z食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 雷公藤甲素（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：180113）。

1.1.3 儀器與試劑 切片機(jī)（天津天利航空機(jī)電有限公司，型號(hào)：OPJ-1B）、電子天平（日本島津，型號(hào)：AEL-40SM）、血糖儀（長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司公司，型號(hào)：GA-7）、顯微鏡（日本OLYMPUS，型號(hào)：Olympus IX71）、PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司，型號(hào)：Step One Plus Real-Time）、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：Bio-RaD）;兔抗小鼠Bax抗體（生產(chǎn)批號(hào)：20180407）及Lc3抗體生產(chǎn)批號(hào)：20180311）均購(gòu)于上海研謹(jǐn)生物科技有限公司、Podocin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180208）、Caspase-3活性測(cè)定試劑盒（北京奧維亞生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180412），鏈尿佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180203），尿白蛋白測(cè)定試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20180315）和尿肌酐測(cè)定試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20180322）購(gòu)于美國(guó)Exocell公司，Western blot及凝膠電泳試劑（南京凱基生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180213）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將60只健康小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為DN組和雷公藤甲素組，每組30只。禁食但不禁水12 h后，對(duì)小鼠注射STZ（55 mg/kg），連續(xù)注射1周，檢測(cè)小鼠空腹血糖，當(dāng)空腹血糖≥13.8 mmol/L，則DM模型構(gòu)建成功。

1.2.2 干預(yù)方法 雷公藤甲素組給予200 μg/（kg·d）劑量的雷公藤甲素灌胃，DN組給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，2組小鼠均連續(xù)12周。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 小鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察 12周后將各組小鼠麻醉后，頸椎脫臼法處死后，取腎臟組織切成小塊，0.3%戊二醛和1%的四氧化鋨進(jìn)行固定，梯度丙酮脫水進(jìn)行石蠟包埋，切片機(jī)切片（厚度5 μm），然后PAS染色，鏡下觀察染色情況，腎小球基膜、系膜基質(zhì)及纖維蛋白等呈紫紅色即為PAS陽(yáng)性物質(zhì)，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色。

1.2.3.2 足細(xì)胞數(shù)量變化觀察 采用WT1免疫組織化學(xué)染色法觀察足細(xì)胞數(shù)量變化情況：取腎臟組織切成小塊，石蠟包埋，切片機(jī)切片（厚度2 μm），檸檬酸鹽高溫修復(fù)，加入滴加一抗WT1（稀釋比例1∶ 500），4 ℃下過(guò)夜后，加入二抗（1∶ 1 000稀釋?zhuān)?0 ℃下孵育15 min，取DBA試劑盒中的A、B、C試劑加至切片顯色，顯色后用純凈水洗掉，終止顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，從各組腎組織切片選取30個(gè)完整腎小球，光鏡進(jìn)行觀察，并對(duì)WT1陽(yáng)性細(xì)胞和足細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3.3 足細(xì)胞自噬情況觀察 12周后將各組小鼠麻醉后，頸椎脫臼法處死后，剪取其少量腎皮質(zhì)，放入冷處理后的2.5%戊二醛中固定，并在固定液中將組織切成小塊（約1 mm3），PBS漂洗3次后，1%餓酸固定1 h，PBS再漂洗3，采用90%丙酮（30%、50%、70%、80%、90%、100%）進(jìn)行梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片機(jī)切片（60 nm），檸檬酸鉛染色后dd H2O沖洗3次，醋酸鈾染色，透射電鏡下觀察腎小球足細(xì)胞自噬情況。

1.2.3.4 Podocin、Lc3、Caspase-3、Bax表達(dá)情況 ? 采用Western-blot法檢測(cè)小鼠腎組織中Podocin、Lc3、Caspase-3、Bax表達(dá)情況：采用改良異硫氰酸胍法提取總蛋白，-80 ℃下凍存，將總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離蛋白，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，然后在封閉液中搖動(dòng)1 h，加入一抗（稀釋度：Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3均為1∶ 500）孵育，4 ℃下過(guò)夜。二抗孵育（1∶ 2 000稀釋?zhuān)? h，免疫熒光增強(qiáng)法顯色，Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)量與β-actin的灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同組間比較采用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組小組腎組織形態(tài)情況 PAS染色結(jié)果顯示，DN組小鼠系膜基質(zhì)明顯增多。見(jiàn)圖1A。雷公藤甲素組小鼠系膜基質(zhì)明顯減少。見(jiàn)圖1B。

2.2 不同組小鼠足細(xì)胞數(shù)量及自噬情況 WT1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，雷公藤甲素組小鼠足細(xì)胞數(shù)量明顯比DN組小鼠增加。見(jiàn)圖2。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，DN組小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷比雷公藤甲素組明顯，且呈空泡樣變。見(jiàn)圖3A、圖3C。自噬體數(shù)量明顯比雷公藤甲素組減少。見(jiàn)圖3B、圖3D。

2.3 不同組小鼠腎組織Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況 與DN組比較，雷公藤甲素組Podocin表達(dá)明顯增加，LC3-II/LC3-I比值明顯上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax及Caspase-3表達(dá)明顯減少（P<0.05）。見(jiàn)表1，圖4。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DN屬于消渴證范疇，患者在“消渴癥，水腫”作用下，會(huì)傷及腎絡(luò)腎體，從而引起腎臟功能的失調(diào)，其基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，其中本虛為五臟陰陽(yáng)氣血虛虧，腎為之根本，標(biāo)實(shí)為濕阻、痰凝、血瘀，毒氣瘀結(jié)，傷及腎絡(luò)[9-10]。腎小球足細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，是腎小球?yàn)V過(guò)膜的最后屏障，但其再生能力非常有限，在DM等應(yīng)激因素的影響下，DN患者體內(nèi)大量受損的細(xì)胞器及蛋白積聚在足細(xì)胞內(nèi)，對(duì)其產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，并發(fā)生凋亡，因此DN進(jìn)展的明顯特點(diǎn)為足細(xì)胞減少，足細(xì)胞損傷是其明顯的標(biāo)志[11-12]。

DN早期會(huì)出現(xiàn)足細(xì)胞損傷情況，并貫穿于DN生理病理整個(gè)活動(dòng)過(guò)程中[13]。本研究結(jié)果顯示，DN組小鼠系膜基質(zhì)明顯增多，雷公藤甲素組小鼠系膜基質(zhì)明顯減少，說(shuō)明DM小鼠腎臟組織存在較嚴(yán)重的病理?yè)p傷。雷公藤甲素具有抗炎及免疫抑制等作用，炎性反應(yīng)會(huì)貫穿于DN發(fā)展過(guò)程中，通過(guò)雷公藤甲素治療可防止炎性反應(yīng)過(guò)度激活，改善系膜基質(zhì)增生情況，從而改善腎組織損傷。

自噬是細(xì)胞在相關(guān)蛋白和基因調(diào)控下維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種生命現(xiàn)象[14]。正常狀態(tài)時(shí)，自噬活性水平較低，當(dāng)受到細(xì)胞內(nèi)代謝壓力及細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)成分變化、生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，其會(huì)被大量激活[15]。目前關(guān)于自噬與腎臟疾病的研究是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)之一，相關(guān)研究表明，自噬對(duì)足細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用[16]。WT-1是一種足細(xì)胞核蛋白，是足細(xì)胞特異性標(biāo)志之一，可反應(yīng)足細(xì)胞數(shù)量變化情況[17]。本研究結(jié)果顯示，DN組小鼠的足細(xì)胞數(shù)量明顯比雷公藤甲素組小鼠減少，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，雷公藤甲素組自噬體數(shù)量明顯比DN組小鼠增多，DN組小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷明顯，并呈空泡樣變。這是因?yàn)镈N小鼠在高糖等應(yīng)激因素刺激下，其足細(xì)胞足突會(huì)增寬、變短及回縮，從而發(fā)生融合，乃至消失，而足細(xì)胞缺失會(huì)影響腎小球?yàn)V過(guò)屏障，導(dǎo)致腎小球硬化。雷公藤甲素可保護(hù)并修復(fù)DN小鼠腎足細(xì)胞損傷，減少足突融合，抑制腎足細(xì)胞的凋亡，通過(guò)激活腎足細(xì)胞自噬活性，從而穩(wěn)定足細(xì)胞的功能與結(jié)構(gòu)，達(dá)起到保護(hù)腎臟的作用。

LC3是公認(rèn)的自噬體標(biāo)記蛋白，在自噬中起重要作用，包括LC3-I和LC3-II兩型，其對(duì)自噬體膜延長(zhǎng)、自噬體膜與其他膜結(jié)構(gòu)的融合及自噬體運(yùn)載其他物質(zhì)的過(guò)程中起到重要的作用[18]。Caspase蛋白是一種在細(xì)胞凋亡過(guò)程中最易被活化的天冬氨酸蛋白水解酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等過(guò)程中其重要作用[19]。Bax是一種凋亡相關(guān)蛋白，可起到促細(xì)胞凋亡作用，其會(huì)激活下游Caspase-3并協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20-21]。Podocin蛋白是維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的主要分子，可保障腎小球?yàn)V過(guò)膜的完整性，可作為足細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志物[22]。本研究結(jié)果顯示，雷公藤甲素組Podocin表達(dá)比DN組明顯增加，LC3-II/LC3-I比值明顯上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax及Caspase-3表達(dá)明顯減少（P<0.05）。這是因?yàn)槔坠偌姿乜缮险{(diào)Podocin蛋白表達(dá)，從而維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，并對(duì)Bax蛋白的同二聚體產(chǎn)生進(jìn)行抑制，將Bax蛋白具備的促細(xì)胞凋亡作用阻斷，從而下調(diào)Bax的表達(dá)，進(jìn)而減少Caspase-3的大量激活，從而阻斷足細(xì)胞凋亡，同時(shí)雷公藤甲素可上調(diào)DN小鼠足細(xì)胞自噬水平，并會(huì)伴隨LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)換。

綜上所述，對(duì)DN小鼠給予雷公藤甲素治療，可減輕足細(xì)胞損傷及缺失，維持足細(xì)胞的功能和數(shù)量，并保障足細(xì)胞的自噬性，可為DN的防治提供的理論依據(jù)。

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（2019-04-15收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）