吉煙9號內(nèi)生細(xì)菌的分離及多樣性分析

閆寒 李虎林 郎彬 等

摘 ?要：為了解烤煙內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，以吉煙9號為供試材料，分別從汪清、和龍、延吉烤煙的根、莖、葉分離得到內(nèi)生細(xì)菌24株、18株、16株，依據(jù)菌落表型特征及16S rRNA序列同源性對分離的內(nèi)生菌進(jìn)行初步鑒定和多樣性分析，結(jié)果表明，主要為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes），其中的芽孢桿菌屬（Bacillus）是3地共同的優(yōu)勢菌屬。Neighbor-joining聚類分析表明，3個取樣地烤煙內(nèi)生細(xì)菌分別劃分為13、9、11個類群。通過數(shù)值分類比較9個表型特征，結(jié)果表明，汪清、和龍在7.2水平聚為5個表觀群，延吉在6.3水平聚為3個表觀群。為吉煙9號內(nèi)生菌的進(jìn)一步應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：烤煙;內(nèi)生細(xì)菌;表型特征;微生物多樣性

中圖分類號：S435.72 ?????????文章編號：1007-5119（2019）01-0075-07 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.010

Abstract： To understand the diversity of endophytic bacteria in flue-cured tobacco， using Jiyan 9 of flue-cured tobacco as the test material， 24， 18 and 16 strains of endophytic bacteria were isolated from roots， stems and leaves of flue-cured tobacco from Wangqing， Helong and Yanji regions respectively. Preliminary identification and diversity analysis of isolated endophytes were carried out based on colony phenotypic characteristics and 16S rRNA sequence homology analysis. The results showed that the endophytes were mainly Proteobacteria， Actinobacteria， and Firmicutes. Among them， Bacillus is a common genus of the three locations. Neighbor-joining cluster analysis showed that the endophytic bacteria of the three sampled flue-cured tobaccos were divided into 13， 9， and 11 groups. Comparing 9 phenotypic features by numerical classification indicated that the Wangqing and Helong strains gathered at the 7.2 level for 5 apparent groups， and the Yanji strains was clustered into 3 apparent groups at the 6.3 level. It provides a theoretical basis for the further application of endophytic bacteria of Jiyan 9.

Keywords： flue-cured tobacco; endophytic bacteria; phenotypic characteristic; microbial diversity

內(nèi)生菌研究距今已有100多年歷史，因受環(huán)境影響小、定殖效果好、作用穩(wěn)定持久的特點而有著獨特且重要的應(yīng)用價值。據(jù)研究表明，植物內(nèi)生菌幾乎存在于地球上的所有植物中[1]。煙草作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，是我國財稅的重要來源，因此，對其內(nèi)生菌的研究也受到眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，內(nèi)生菌作為微生物菌肥，具有固氮、溶磷、解鉀、降煙堿和亞硝酸鹽及抵抗病原菌等功效[2-6]，在提高煙草重金屬耐受性和污染環(huán)境修復(fù)方面也有積極作用[7-9]，部分菌肥已商品化并在多種作物栽培中應(yīng)用。

吉煙9號作為吉林省烤煙的主推品種，在延邊、長春、白城等煙區(qū)廣泛種植。為促進(jìn)煙株正常生長，獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益，在煙葉的生產(chǎn)中，使用了化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料，帶來經(jīng)濟(jì)效益的同時，煙區(qū)的生態(tài)環(huán)境也受到了嚴(yán)重影響，如病蟲害抗藥性增加，土壤板結(jié)，重金屬含量超標(biāo)，水體污染等。近年來，對吉煙9號內(nèi)生菌的研究鮮有報道，為此，本試驗以吉煙9號為材料，分離團(tuán)棵期內(nèi)生細(xì)菌并研究其在不同生態(tài)環(huán)境的多樣性，旨在為吉煙9號內(nèi)生菌在病害防治和菌肥研究等方面提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?樣品采集與處理

本試驗以團(tuán)棵期吉煙9號的根、莖、葉為材料，采用五點取樣法取樣，取樣時間為2017年7月，樣品分別取自延邊州汪清縣、和龍市和延吉市，取樣地土壤養(yǎng)分概況如表1。采樣時選擇無病蟲害的健康植株，采集后將根、莖、葉立刻裝入自封袋中，低溫保存，在24 h內(nèi)完成內(nèi)生菌的分離。

1.2 ?培養(yǎng)基及主要試劑

內(nèi)生細(xì)菌的分離、培養(yǎng)均采用NA培養(yǎng)基（Becton， Dickinson and Company， USA）。細(xì)菌DNA的提取及擴(kuò)增使用的試劑均為分析純，rTaq、dNTP、Buffer Mg（-）、MgCl2等為寶生物工程（大連）產(chǎn)品。細(xì)菌通用引物27f和1492r由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 ?內(nèi)生細(xì)菌的分離

參照陳澤斌等[10]的方法將采集的根、莖、葉樣

品進(jìn)行表面消毒。取消毒徹底的樣品材料1 g與滅菌的石英砂一同放入研缽中研磨，研磨后的樣品加入9 mL生理鹽水，隨后稀釋成10-2、10-3、10-4，將稀釋液涂布于NA培養(yǎng)基上，每個處理重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)48 h后，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色等挑取單菌落，經(jīng)反復(fù)劃線純化，挑取單菌落置于30%甘油中，?70 ℃保存?zhèn)溆?。

1.4 ?表型特征的統(tǒng)計及聚類分析

根據(jù)菌落的顏色、形狀、大小、表面、邊緣、干濕、質(zhì)地、色素及透明度與否9個指標(biāo)對菌落形態(tài)進(jìn)行歸類，按照表2編碼并記錄結(jié)果，對于完全相同的表型特征的菌株只選一株作為代表菌株，用SPSS 20進(jìn)行聚類分析，得到表型特征的數(shù)值分類聚類圖。

1.5 ?內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA序列分析

采用改進(jìn)SDS-CTAB方法提取細(xì)菌基因組DNA[11]，PCR反應(yīng)體系（25 μL）組成：10×Buffer Mg（-） 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物27f 2 μL、引物1492r 2 μL、模板DNA 2 μL、Taq酶0.2 μL、滅菌蒸餾水11.8 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 30 s預(yù)變性;94 ℃ 1 min變性，55 ℃退火，?72 ℃ 1.5 min延伸，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（長春）股份有限公司測序，擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank進(jìn)行BLAST分析獲取同源性最高的菌株。以Neighbor-joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap（自展值1000）進(jìn)行檢驗。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?內(nèi)生細(xì)菌的分離

從汪清樣品中分離純化得到內(nèi)生細(xì)菌24株，其根中分離出12株，莖中分離出8株，葉中分離出4株;從和龍的樣品中分離純化得到內(nèi)生細(xì)菌18株，其根中分離出15株，莖中分離出1株，葉中分離出2株;從延吉的樣品中分離純化得到內(nèi)生細(xì)菌16株，其根中分離出9株，莖中分離出5株，葉中分離出2株;3地分離的內(nèi)生菌的數(shù)量：汪清>和龍>延吉（表3）。

2.2 ?表型特征的統(tǒng)計及聚類分析

從汪清、和龍及延吉分離的內(nèi)生菌的表型特征的數(shù)值分類聚類圖來看，3個地點的內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的表型（表4），汪清分離的內(nèi)生細(xì)菌，在歐式距離為7.2時，聚為5個表觀群，在歐式距離為0.9時，聚為22個亞群（圖1）;和龍分離的內(nèi)生細(xì)菌，在歐式距離為7.2時，聚為5個表觀群，在歐式距離為0.9時，聚為17個亞群（圖2）;延吉分離的內(nèi)生細(xì)菌，在歐式距離為6.3時，聚為3個表觀群，在歐式距離為0.9時，聚為15個亞群（圖3）。

2.3 ?內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA序列分析

測序獲得了來自汪清、和龍及延吉的全部內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析如圖4～6。結(jié)果表明，烤煙中分離的內(nèi)生菌依據(jù)細(xì)菌表型特征的聚類結(jié)果與依據(jù)細(xì)菌16S rRNA序列的聚類結(jié)果不完全一致，如汪清烤煙分離的菌株中Y92、Y129、Y69、Y12、Y128、Y5、Y60、Y66按數(shù)值分類為一個表觀群，但在16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上Y129、Y69、Y12、Y128與Y92、Y66、Y5及Y60卻沒有聚為一個類群;和龍烤煙分離的菌株中Y27、Y60、Y92、Y18按數(shù)值分類為一個表觀群，但在16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上Y27、Y60、Y92卻沒有聚為一個類群;而在延吉烤煙分離的菌株中Y120、Y121、Y4、Y125、Y54按數(shù)值分類與在16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上均聚為一個類群，說明菌落形態(tài)相近不能決定親緣關(guān)系遠(yuǎn)近;

同時，多個菌落形態(tài)類型的細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上被聚為一個類群，如汪清中的Fir 1類群與和龍中的Pro1、Pro 2類群，其包括A、D、E 3個表觀群中的某些亞群。

通過對汪清、和龍及延吉3地烤煙的內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA的測序結(jié)果與Gen Bank中進(jìn)行BLAST比對，測定結(jié)果表明，3地分離的細(xì)菌與已知分類地位菌種的序列相似性在98%～100%，大部分為100%（表3）。汪清、和龍、延吉分離得到的內(nèi)生細(xì)菌中厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）分別有7株、5株、4株，分別占分離菌株總數(shù)的29.17%、27.78%、25%，為3地烤煙中的優(yōu)勢菌屬。由此可知，吉煙9號內(nèi)生菌的優(yōu)勢種群是厚壁菌門的芽孢桿菌屬。且3地分離的內(nèi)生菌種類數(shù)：汪清>延吉>和龍。

總體來看，汪清烤煙分離的內(nèi)生細(xì)菌在數(shù)量和種類上較其他兩地都多。

3 ?討 ?論

本試驗研究表明，烤煙中分離的內(nèi)生菌依據(jù)數(shù)值分類聚類結(jié)果與依據(jù)細(xì)菌16S rRNA序列的聚類結(jié)果不完全一致，數(shù)值分類為一個表觀群的，在16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上可能聚為一個類群（延吉），也可能不聚為一個類群（汪清、和龍）。其可能的原因有：一是觀察者對細(xì)菌表型特征主觀判斷誤差引起的;二是表型特征在不同類群中進(jìn)化速度差異很大，甚至基因相同的個體在不同的環(huán)境下發(fā)育也可能出現(xiàn)顯著差異;另外，系統(tǒng)發(fā)育樹表示的是細(xì)菌的進(jìn)化及親緣關(guān)系，而數(shù)值分類是根據(jù)表型特征，反映的僅僅是表型間的關(guān)系，并不能反映細(xì)菌的進(jìn)化及親緣關(guān)系。這與陳澤斌等[10]對旺長期煙草研究結(jié)果相同。這就說明菌落形態(tài)相近不能決定親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

從汪清、和龍及延吉分離的內(nèi)生菌均以厚壁菌門的芽孢桿菌屬的細(xì)菌數(shù)量最多，為優(yōu)勢菌屬。這與王茂勝等[12]、林鳳敏等[13]對煙草的研究結(jié)果及武永秀等[14]對野生春蘭根的研究結(jié)果相同，這可能與芽孢桿菌屬細(xì)菌在植物體內(nèi)多是以孢子形式存在，定殖能力強有關(guān)。

據(jù)研究表明，假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）以及土壤桿菌屬（Agrobacterium）為植物內(nèi)生細(xì)菌最常見的屬[15]，但尚未見從煙草中分離出腸桿菌屬和土壤桿菌屬的報道。而本試驗對以上4個屬在吉煙9號中均分離得到。土壤桿菌屬在汪清的根中發(fā)現(xiàn)2株、和龍的根中發(fā)現(xiàn)1株;假單胞菌屬在汪清的根中發(fā)現(xiàn)2株，和龍的根中發(fā)現(xiàn)4株;腸桿菌屬僅在汪清烤煙的莖中分離出1株?？赡艿脑蚴菬煵萜贩N、取樣地點、取樣時期、材料表面消毒方法及培養(yǎng)基不同所致。汪清分離的內(nèi)生菌無論在數(shù)量還是種類上較和龍和延吉都多，可能是由于汪清煙田較其他兩地的速效氮、磷、鉀含量高，土壤中的營養(yǎng)成分對內(nèi)生菌的種類和數(shù)量影響顯著所致。

3地分離的共58株內(nèi)生細(xì)菌中的芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬等據(jù)資料顯示在抵抗病原菌、解磷解鉀、污染修復(fù)等方面均有顯著成效，但雷夫松氏菌屬（Leifsonia）、莫拉氏菌屬（Moraxella sp.）、摩氏摩根菌屬（Morganella morganii）等菌屬的作用鮮有報道，今后將圍繞分離得到的內(nèi)生菌在對煙草的促生效果方面進(jìn)行深入研究，為微生物菌肥的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

4 ?結(jié) ?論

本研究從吉煙9號中均分離得到4種其他植物中常見的菌屬（假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬及土壤桿菌屬），其中芽孢桿菌屬（Bacillus）是汪清、和龍、延吉烤煙內(nèi)生菌中的優(yōu)勢菌屬?？緹熤蟹蛛x的內(nèi)生菌依據(jù)數(shù)值分類為一個表觀群的，在16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上可能聚為一個類群，也可能不聚為一個類群，表明菌落形態(tài)相近不能決定親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

參考文獻(xiàn)

[1]STIERLE A， STROBEL G， STIERLE D. Taxol and taxane production by Taxomycesandreanae， an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science， 1993， 260（5105）： 214-216.

[2]張?zhí)鞐?，李庚，湯丹? 降低煙葉煙堿和亞硝酸鹽的煙草內(nèi)生菌篩選及代謝產(chǎn)物應(yīng)用[J]. 食品工業(yè)，2011（4）：6-8.

ZHANG T D， LI G，TANG D Y. Tobacco endophytic screening and metabolite application for reducing nicotine and nitrite in tobacco leaves[J]. Food Industry，

2011（4）： 6-8.

[3]STROBEL G， DAISY B， CASTILLO U， et al. Natural products from endophytic microorganisms[J]. Journal of Natural Products， 2004， 67（2）： 257-268.

[4]邢穎，張莘，郝志鵬，等. 煙草內(nèi)生菌資源及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報，2015，42（2）：411?419.

XING Y， ZHANG Z， HAO Z P， et al. Advances in studies on tobacco endophytic resources and their applications[J]. Microbiology Bulletin， 2015， 42（2）： 411-419.

[5]姜乾坤，彭閣，王瑞，等. 抗青枯內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其對煙草青枯病的防治效果[J]. 中國煙草科學(xué)，2017，38（5）：13-17，31.

JIANG Q K， PENG G，WANG R， et al. Screening of endophytic bacteria in Qingyan and Its control effect on tobacco bacterial wilt[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（5）： 13-17， 31.

[6]劉璇，孔凡玉，張成省，等. 煙草根際解鉀菌的篩選與鑒定[J]. 中國煙草科學(xué)，2012，33（3）：28-31.

LIU X， KONG F Y， ZHANG C X， et al. Screening and identification of potassium bacteria in tobacco rhizosphere [J]. Chinese Tobacco Science， 2012， 33（3）： 28-31.

[7]MASTRETTA C， TAGHAVI S， VAN DER LELIE D， et al. Endophytic bacteria from seeds of Nicotiana tabacum can reduce cadmium phytotoxicity[J]. International Journal of Phytoremediation， 2009， 11（3）： 251-267.

[8]NARASIMHAN K， BASHEER C， BAJIC V B， et al. Enhancement of plant-microbe interactions using a rhizosphere metabolomics-driven approach and its application in the removal of polychlorinated biphenyls[J]. Plant Physiology， 2003， 132（1）： 146-153.

[9]KHAN A A， WALIA S K. Expression， localization， and functional analysis of polychlorinated biphenyl degradation genes cbpABCD of Pseudomonas putida[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1991， 57（5）： 1325-1332.

[10]陳澤斌，夏振遠(yuǎn)，雷麗萍，等. 煙草可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離及多樣性分析[J]. 微生物學(xué)通報，2011，38（9）：1347-1354.

CHEN Z B， XIA Z Y， LEI L P， et al. Isolation and diversity analysis of endophytic bacteria in tobacco[J]. Microbiology Bulletin， 2011， 38（9）： 1347-1354.

[11]科瓦爾庫克，德?布魯金，海德，等. 分子微生物生態(tài)學(xué)手冊[M]. 丁雄，譯. 2版. 荷蘭多德雷赫特：克盧沃學(xué)術(shù)出版社，2004.

KOWALCHK G A， DE BRUJIN F J， HEAD I M， et al. Molecular Microbiology Ecology Manual[M]. DING X， compiled. Second Edition. Dordrecht， Netherlands： Kluwer Academic Publishers， 2004.

[12]王茂勝，汪漢成，馬瑩，等. 煙草內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（23）：59-64.

WANG M S， WANG H C， MA Y， et al. Research on endophytic bacterial diversity of tobacco[J]. Guangdong Agricultural of Sciences， 2015（23）： 59-64.

[13]林鳳敏，姬文秀，李虎林. 煙草根際與非根際細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（5）：1058-1062.

LIN F M， JI W X， LI H L. Phylogenetic diversity of tobacco rhizosphere and non-rhizosphere bacteria [J]. Hubei Agricultural of Sciences， 2011， 50（5）： 1058-1062.

[14]武永秀，宋彤彤，張瑞英，等. 天目山野生春蘭根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究[J]. 生物技術(shù)通報，2014（5）：170-173.

WU Y X， SONG T T， ZHANG R Y， et al. Study on the diversity of endophytic bacteria cultured in wild spring orchid roots in Tianmu mountain[J]. Biotechnology Bulletin， 2014（5）： 170-173.

[15]陳宜濤，王偉劍. 植物內(nèi)生菌的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9（16）：3169-3172.

CHEN Y T， WANG W J. Advances in research on endophytes in plants[J]. Progress in Modern Biomedicine， 2009， 9（16）： 3169-3172.