陳辰 朱潤琪 倪新程 等

摘 ?要：針對降解高毒、高危害的尼古丁微生物種類較少的實(shí)際情況篩選出具有高尼古丁降解活性的菌株，探究其降解條件及降解特性，為尼古丁的生物降解提供新的微生物資源。從煙草種植大田土壤分離純化得到一株具有高尼古丁降解能力的菌株，對其形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA基因序列同源性進(jìn)行了分析鑒定，探究了不同條件下尼古丁降解特性并對其動態(tài)降解過程進(jìn)行了HPLC分析。經(jīng)鑒定命名為Stenotrophomonas sp. ZUC-3，適宜的發(fā)酵條件為：溫度30 ℃、起始pH 7.0、接種量10%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min，此條件下尼古丁降解率可達(dá)到91.53%，HPLC分析顯示了ZUC-3降解尼古丁過程的動態(tài)變化及其高效性。研究結(jié)果為尼古丁生物降解提供了新的微生物資源，對煙草行業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有理論意義與實(shí)際應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：尼古丁;生物降解;Stenotrophomonas sp. ZUC-3;降解特性

中圖分類號：TS41+1 ?????????文章編號：1007-5119（2019）01-0089-09 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.012

Abstract： The aim of this study was to isolate and identify a strain with high nicotine degradation activity in the situation where there are few kinds of nicotine-degrading microorganisms available， and to explore the conditions and characteristics of nicotine degradation， which will provide a new microbiological resource for the biodegradation of nicotine. A strain with high activity of nicotine degradation was obtained by isolation and purification from tobacco field soil. The strain was identified by morphological， physio-biochemical and 16S rRNA gene analysis， and the characteristics of nicotine degradation under different conditions were investigated with dynamic process by HPLC analysis. The optimum condition of nicotine degradation by Stenotrophomonas sp. ZUC-3 was 30 ℃ with 10% inoculum at the initial pH 7.0 and 180 r/min， in which the rate of nicotine degradation by Stenotrophomonas sp. ZUC-3 reached 91.53%. HPLC analysis illustrated the dynamic process and high efficiency of nicotine degradation. The study provides a new microbiological resource for biodegradation of nicotine and has theoretical and practical significance in tobacco industry.

Keywords： nicotine; biodegradation; Stenotrophomonas sp. ZUC-3; degradation characteristics

尼古?。∟icotine）具有高毒性，可透過生物膜，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易降解[1]，并且是致癌物質(zhì)煙草特有亞硝胺（TSNAs）的重要前體物[2]，由于其特殊的水溶性，能夠與水以任意比例互溶，對人類生活及生態(tài)環(huán)境是一個極大的威脅[3]。我國作為世界上最大的煙草種植和加工生產(chǎn)的國家，在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量含高濃度尼古丁的煙草加工廢棄物[4]，所以環(huán)境中尼古丁的高效降解是目前一個亟待解決的問題。

微生物在自然環(huán)境下尼古丁的降解中扮演著極其重要的角色，YAO等[5]于煙草廢棄物中分離出一株具有尼古丁降解能力的菌株，經(jīng)鑒定為節(jié)桿菌屬Arthrobacter sp. M2012083，通過對其基因組測序，預(yù)測了尼古丁代謝關(guān)鍵基因pAO1，但并未發(fā)現(xiàn)編碼于質(zhì)粒上的代謝功能基因。CHEN等[6]于煙草種植土壤中分離并鑒定出一株具有尼古丁降解性能的假單胞菌Pseudomonas sp. Nic22，并對其降解條件進(jìn)行探究，結(jié)果表明，在30～34 ℃、pH 6.5條件下，48 h內(nèi)可降解2 g/L的尼古丁。YUAN等[7]從煙草種植土壤中分離并鑒定出一株尼古丁降解菌中間蒼白桿菌Ochrobactrum intermedium DN2，研究結(jié)果表明，該菌株降解尼古丁的最佳條件為30～37 ℃、pH 6.5，平均降解速率為140.5 mg/（L·h）。MENG等[8]于煙草葉片中分離并鑒定出一株具有尼古丁降解能力的曲霉屬真菌Aspergillus oryzae 112822，結(jié)果表明，在28 ℃、pH 6.5條件下培養(yǎng)40 h后，該菌株的最高生長量為3.6 g/L，最高尼古丁降解量為2.19 g/L。生物降解相對于物理和化學(xué)降解過程，具有低成本、高效性、高選擇性、環(huán)境友好等優(yōu)勢[9]，而且尼古丁降解微生物可將尼古丁轉(zhuǎn)化為多種可再生的功能性中間代謝產(chǎn)物，例如生成的吡啶可作為前體物產(chǎn)生具有高醫(yī)用價值的藥物，也可作為高效安全的殺蟲劑應(yīng)用于生物防治領(lǐng)域[10-11]，過程簡便可控，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用前景。

目前已報道的尼古丁降解微生物種類較為單一[12-14]，主要集中在節(jié)桿菌屬[15-16]（Arthrobacter sp.）、根癌農(nóng)桿菌[17-18]（Agrobacterium tumefaciens）、假單胞菌屬[19-21]（Pseudomonas sp.）、蒼白桿菌屬[22]（Ochrobactrum sp.）、芽孢桿菌[21]（Bacillus thuringiensis）及某些真菌[22]。不同菌種對尼古丁降解的途徑也不同，目前研究比較清楚的是以節(jié)桿菌為代表的吡啶途徑[25]和以假單胞菌為代表的吡咯途徑[26]。除此之外，某些煙草內(nèi)生真菌具有特殊的尼古丁降解途徑，但具體機(jī)制尚不清楚。

本研究從煙田土壤取樣，分離出一株新的高活性尼古丁降解菌，并對其形態(tài)學(xué)、生理生化特性、16S rRNA基因序列進(jìn)行分析鑒定，探究其降解特性，旨在為尼古丁生物降解領(lǐng)域微生物資源的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

土壤樣品：采自湖南省郴州市煙草種植基地。

1.2 ?培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：NaCL 10.0 g/L，胰蛋白胨 10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，溶解于蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

尼古丁培養(yǎng)基：K2HPO4 13.30 g/L，KH2PO4 4.00 g/L，（NH4）2SO4 0.01 g/L，酵母粉1.00 g/L，尼古丁2.00 g/L;微量元素溶液10.00 mL（MgSO4·7H2O 1.00 g，MnSO4·H2O 0.40 g，CaCl2 0.15 g，CuCl2·2H2O 0.20 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，用0.10 mol/L HCL溶解至100 mL），溶解于蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

尼古丁固體培養(yǎng)基：同尼古丁培養(yǎng)基，加入1.8%的瓊脂即可。

1.3 ?儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司;SYQ-DS2X-280B高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠;UV-2600紫外分光光度計：日本島津公司;HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司;SI-0246漩渦混合儀：美國Scientific Industries公司;T100 PCR儀：美國Bio-Rad公司;Avanti J-25高速冷凍離心機(jī)：美國Beckman Coulter有限公司;JY3000C電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;JCM-6000 Plus臺式SEM掃描電鏡：日本電子株式會社（JEOL）;Agilent1200高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司等。

1.4 ?方法

1.4.1 ?尼古丁降解菌的篩選與分離 ?取5 g土壤樣品于95 mL帶玻璃珠的無菌生理鹽水中，30 ℃、180 r/min振蕩20 min，靜置5 min后取土壤菌懸液，用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，涂布于尼古丁固體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)，定期觀察，采用平板劃線法多次分離純化，挑取初篩的單菌落接種于尼古丁培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2～3 d，定時取樣，測定發(fā)酵液尼古丁濃度及菌體生長量，選取降解情況最佳的菌株為目的菌株。

1.4.2 ?菌種鑒定 ?形態(tài)結(jié)構(gòu)：將純化后的目的菌種接種于固體尼古丁培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)，染色鏡檢觀察菌體基本生理特征，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察菌體形態(tài)。

生理生化特征：生理生化指標(biāo)的測定及方法參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[28]。

16S rRNA基因序列同源性分析：（1）將目的菌株于30 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h作為種子液，然后按5%接種量轉(zhuǎn)接于新鮮尼古丁培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。使用Axygen細(xì)菌基因組DNA制備試劑盒，按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取基因組DNA。（2）以提取的目的基因組DNA為模板，16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)PCR 擴(kuò)增片段。（3）取純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測定，將序列結(jié)果進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3 ?菌株ZUC-3的降解特性試驗(yàn) ?將種子液接入裝液量為100 mL/250 mL的尼古丁培養(yǎng)基中，設(shè)置不同溫度：25、30、37 ℃;不同pH：4、5、6、7、8、9、10;不同初始尼古丁濃度：1、2、3、4、5、6、7、8 g/L;不同接種量：5%、10%、15%;不同發(fā)酵方式：靜置、120 r/min、180 r/min，定時取樣，連續(xù)測定降解情況，探究溫度、pH、接種量、初始尼古丁濃度、轉(zhuǎn)速對ZUC-3降解尼古丁的影響。

1.4.4 ?ZUC-3降解尼古丁的HPLC檢測 ?將種子液以10%的接種量接入尼古丁培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，定時取樣，發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 ?m無菌濾膜，進(jìn)行HPLC檢測。HPLC條件為：檢測波長為259 nm，色譜柱為C18柱（4.6×250 mm，5 ?m），流動相為甲醇（色譜純）：水（1 mmol/L H2SO4）=10∶90，柱溫30 ℃，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 ?L。

1.5 ?測定指標(biāo)及方法

尼古丁濃度測定：尼古丁在波長為259 nm處

存在吸收峰，采用紫外分光光度法測定尼古丁濃度。

將菌株ZUC-3于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，定時取樣，發(fā)酵液離心（12 000 r/min，10 min，4 ℃）后，測定在259 nm處的吸光值。

菌體生長量測定：將菌株ZUC-3于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，定時取樣，采用紫外分光光度法測定菌體生長量，測定在600 nm處的吸光度，以O(shè)D600表示。

1.6 ?數(shù)據(jù)處理

每個處理均設(shè)置3個重復(fù)，采用SPSS 20.0和R 3.5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?尼古丁降解菌ZUC-3的分離及對尼古丁降解作用

將ZUC-3以5%的接種量接入尼古丁培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后，測定吸收光譜，結(jié)果如圖1所示，對照組（CK）在259 nm存在吸收峰，接入ZUC-3菌株發(fā)酵48 h處理吸收峰消失，表明ZUC-3具有尼古丁降解能力。發(fā)酵液顏色在降解過程中也發(fā)生明顯變化：初期沒有發(fā)生顏色變化，當(dāng)培養(yǎng)至12 h左右發(fā)酵液顏色開始變綠，隨著時間增加顏色逐漸變深呈墨綠色，24 h左右墨綠色開始褪去，發(fā)酵液顏色變?yōu)樯詈稚?，這與目前已報道的微生物降解尼古丁過程中的發(fā)酵液顏色變化有所不同，表明尼古丁降解過程中生成的中間產(chǎn)物可能不同。

2.2 ?ZUC-3菌種鑒定

2.2.1 ?形態(tài)學(xué)特征 ?ZUC-3在尼古丁固體培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)初期較小，顏色通透，圓形，中間凸起，表面光滑，四周平滑無隆起，色澤濕潤光亮（圖2a）;當(dāng)培養(yǎng)至一周左右，菌落變大，呈米黃色，不透明，圓形，表面光滑，中間突起，四周略微有隆起（圖2b）;當(dāng)培養(yǎng)至2～3周，菌落呈暗褐色（圖2c），可能是ZUC-3在尼古丁降解過程中產(chǎn)生的有色代謝產(chǎn)物。SEM電鏡結(jié)果顯示菌體結(jié)構(gòu)呈桿狀，無鞭毛，大小為（2.1～2.3） ?m×（0.7～0.9） ?m（圖2d）。

2.2.2 ?生理生化特征 ?ZUC-3為革蘭氏陰性菌，無芽孢，好氧、運(yùn)動，生長溫度范圍為4～39 ℃，pH生長范圍為5～11?？衫闷咸烟?、麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖等碳源，發(fā)酵產(chǎn)酸緩慢或不產(chǎn)，能夠還原硝酸鹽，水解明膠，DNase、脂酶試驗(yàn)呈陽性，氧化酶、V-P、吲哚、甲基紅、H2S、檸檬酸鹽試驗(yàn)均呈陰性。

2.2.3 ?16S rRNA基因序列同源性分析 ?尼古丁降解菌ZUC-3的16S rRNA基因序列長度為1450 bp，將序列結(jié)果提交至GenBank，獲得登錄號MH 183291，用BLAST工具進(jìn)行序列相似性比較，隨機(jī)選取同源性較高的序列，進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示ZUC-3與Stenotrophomonas分枝較近?；趯δ峁哦〗到饩?/p>

ZUC-3的形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及16S rRNA基因序列同源性分析，初步確定ZUC-3為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），命名為Stenotrophomonas sp. ZUC-3，該菌株已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2018346。

2.3 ?Stenotrophomonas sp. ZUC-3的降解特性

2.3.1 ?寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3生長與尼古丁降解的關(guān)系 ?將ZUC-3以5%接種量接種于新鮮尼古丁培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，定時取樣，連續(xù)測定降解過程中尼古丁濃度的變化及ZUC-3的生長情況，結(jié)果如圖4所示。菌株ZUC-3在0～12 h處于延滯期，生長較為緩慢，尼古丁降解緩慢;12～24 h，ZUC-3進(jìn)入指數(shù)生長期，菌體生長速率最大，此時尼古丁降解速率也達(dá)到最大;30 h左右，ZUC-3生長量達(dá)到最大值，此時發(fā)酵液中尼古丁濃度降到0.45 g/L，降解率為78%;隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，尼古丁不斷降解，48 h時發(fā)酵液中尼古丁已降至0.17 g/L，降解率達(dá)到91%，表明菌株ZUC-3對尼古丁具有高效降解的能力，菌體生長與尼古丁降解同步。

2.3.2 ?溫度對寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3降解尼古丁的影響 ?不同溫度對ZUC-3降解尼古丁的影響如圖5

所示，溫度對ZUC-3降解尼古?。▓D5a）及生長（圖5b）的影響顯著，30 ℃時ZUC-3降解尼古丁及生長狀況最好，48 h時發(fā)酵液中尼古丁含量已降至0.11 g/L，48 h時基本完全降解;而25 ℃時菌體生長緩慢，尼古丁降解效率低，僅在18～24 h時尼古丁有所降解，其他時段幾乎檢測不到明顯的降解，發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)基尼古丁濃度依然高達(dá)1.2 g/L。而在37 ℃時寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3在尼古丁培養(yǎng)基中幾乎不生長，幾乎沒有發(fā)生尼古丁的降解，表明ZUC-3代謝尼古丁對溫度較為敏感。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)37 ℃下ZUC-3在LB培養(yǎng)基中卻可以正常生長，即37 ℃條件下只限制了ZUC-3對尼古丁的代謝能力，并未影響其正常生長能力。

2.3.3 ?pH對寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3降解尼古丁的影響 ?分別將ZUC-3接種于不同起始pH的尼古丁培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后測定尼古丁濃度，計算降解率，結(jié)果如圖6所示，不同pH對ZUC-3降解尼古丁的影響顯著，其中在pH為6～7時，ZUC-3具有最好的尼古丁降解效果，pH為7時降解率最高，達(dá)到91%，而pH為4和10時，尼古丁降解率分別只有6.8%和20.3%，表明過酸或者過堿環(huán)境均不利于ZUC-3降解尼古丁。

2.3.4 ?接種量對寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3降解尼古丁的影響 ?不同接種量對ZUC-3降解尼古丁的影響如圖7所示，3種接種量對尼古丁降解的影響差別不大，相比而言ZUC-3在10%的接種量下對尼古丁的降解效果最好。ZUC-3在3種接種量下，降解趨勢幾乎相同，均在12～24 h階段降解速率達(dá)到最大，36 h達(dá)到降解終點(diǎn)，尼古丁降解充分。在本試驗(yàn)中，接種量對ZUC-3代謝尼古丁的影響不大，非主要參考因素，在后續(xù)試驗(yàn)中ZUC-3的接種量設(shè)置為10%。

2.3.5 ?發(fā)酵方式對寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3降解尼古丁的影響 ?不同發(fā)酵方式對ZUC-3降解尼古丁的影響如圖8所示，由圖可知，不同發(fā)酵方式對ZUC-3降解尼古丁的影響明顯，3種方式在前12 h內(nèi)降解效果差別不大，12 h后開始出現(xiàn)較大差異，靜置狀態(tài)發(fā)酵時，尼古丁的降解率只有31.6%，而120 r/min和180 r/min時降解率分別為73.5%和92%，表明尼古丁的降解為耗氧過程，而轉(zhuǎn)速的高低直接影響發(fā)酵液中的溶氧量，影響尼古丁的降解效果。

2.3.6 ?初始尼古丁濃度對寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3降解尼古丁的影響 ?將寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3分別接種到不同初始尼古丁濃度的尼古丁培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中的尼古丁濃度，計算降解率，考察ZUC-3對尼古丁的耐受程度。結(jié)果如圖9所示，培養(yǎng)基初始尼古丁濃度在1～5 g/L時，尼古丁降解率均在80%以上，其中當(dāng)初始尼古丁濃度為6 g/L時，尼古丁降解率降到49.01%，當(dāng)尼古丁濃度高于7 g/L時，尼古丁降解率低至20%以下，表明ZUC-3降解尼古丁的活性范圍為1～6 g/L，即ZUC-3菌株對尼古丁耐受性濃度為6 g/L。

2.4 ?寡養(yǎng)單胞菌ZUC-3降解尼古丁的HPLC分析

對不同時間下尼古丁降解情況進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如圖10所示，0 h時尼古丁的保留時間在8.96 min左右，色譜峰清晰而完整，峰高為2 786.06 mAU。12 h時，尼古丁色譜峰降低，同時在5.24、5.47和10.31 min處產(chǎn)生新峰，表明尼古丁降解并產(chǎn)生中間產(chǎn)物。培養(yǎng)至24 h時，8.96 min處色譜峰消失，同時在2.60、2.79和3.71 min處產(chǎn)生新峰，即尼古丁進(jìn)一步代謝所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。36 h時出峰位置同24 h時相同，但峰高及峰面積明顯減少，表明中間產(chǎn)物也在繼續(xù)代謝。48 h后，色譜峰值顯著降低，峰值只有400 mAU，尼古丁降解產(chǎn)物種類和含量趨于穩(wěn)定，降解過程到達(dá)終點(diǎn)。結(jié)果揭示ZUC-3高效的尼古丁降解能力，并且在代謝過程中產(chǎn)生了幾種不同的中間代謝產(chǎn)物。

3 ?討 ?論

本研究分離并鑒定得到一株具有高效尼古丁降解性能的菌株寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）ZUC-3，具體是否為該屬新種還需進(jìn)一步做全基因組測序及基因組ANI等相關(guān)分析，關(guān)于該菌種對尼古高降解活性的研究尚未見有報道[29-31]。生長-降解關(guān)系顯示ZUC-3生長與尼古丁降解的同步性，即通過分解代謝尼古丁供給自身生長所需碳氮源及能源，這與TARARINA等[32]、ZHANG等[33]、

BRANDSCH[34]等報道的尼古丁降解微生物的生長-降解關(guān)系相一致。溫度對尼古丁降解菌ZUC-3的影響顯著，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)37 ℃條件下ZUC-3在尼古丁培養(yǎng)基中幾乎不生長，但在LB普通培養(yǎng)基中卻生長良好，先前IGLOI等[36]報道了尼古丁代謝質(zhì)粒pAO1的功能相關(guān)基因序列及其介導(dǎo)的尼古丁代謝調(diào)控系統(tǒng)，因此推測ZUC-3的尼古丁降解相關(guān)基因可能編碼于某類質(zhì)粒上，當(dāng)溫度較高時（37 ℃）時則出現(xiàn)質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，導(dǎo)致ZUC-3雖然可以在LB培養(yǎng)基上生長，但由于喪失了分解利用尼古丁的能力，從而無法在尼古丁培養(yǎng)基上生長，后續(xù)將通過測序探究ZUC-3是否具有該類功能性質(zhì)粒。

pH和發(fā)酵方式對ZUC-3降解尼古丁的影響顯著，ZUC-3的生長和尼古丁降解均在初始pH 7左右時為宜，這與普遍情況下寡養(yǎng)單胞菌的最適生長pH相一致[37];目前關(guān)于尼古丁降解微生物的相關(guān)報道均顯示尼古丁的分解代謝為耗氧過程[18，22，38]，本試驗(yàn)通過設(shè)置不同發(fā)酵方式，結(jié)果表明ZUC-3的尼古丁代謝為耗氧過程，與先前文獻(xiàn)報道相一致。耐受性試驗(yàn)表明ZUC-3具有較高的尼古丁耐受能力，在1～6 g/L尼古丁濃度范圍內(nèi)均具有較高的降解活性，與目前報道較多的尼古丁降解微生物Pseudomonas sp.（1～4 g/L），Arthrobacter sp.（0.5～2 g/L）等相比[39-40]，ZUC-3具備更高的尼古丁耐受性及降解效果。

通過HPLC動態(tài)檢測ZUC-3的尼古丁降解過程，伴隨尼古丁的逐步降解，觀察到不同中間代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與消耗，顯示出ZUC-3的高效尼古丁降解性能。與已報道[38，41-42]的研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)結(jié)果顯示ZUC-3降解尼古丁過程中可能產(chǎn)生了不同的中間代謝產(chǎn)物，推測ZUC-3可能遵從一種新的途徑或是已知途徑之間復(fù)雜的相互交聯(lián)而形成的變形途徑，具體機(jī)制需要對代謝產(chǎn)物做質(zhì)譜鑒定，并結(jié)合基因組測序預(yù)測尼古丁降解相關(guān)基因及基因簇，闡述完整代謝通路。

通過探究尼古丁降解菌Stenotrophomonas ZUC-3的探究特性及降解過程，發(fā)現(xiàn)ZUC-3不僅對尼古丁具有高效的降解活性，而且具有較高的耐受性，尤其適合對目前煙草工業(yè)廢棄物高濃度尼古丁污染物的降害處理，而且無需消耗其他輔助能源，既對環(huán)境友好，又節(jié)能降耗，有利于煙草工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

4 ?結(jié) ?論

分離鑒定得到一株具有高效尼古丁降解活性的寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp. ZUC-3。尼古丁降解特性表明，ZUC-3在1～6 g/L范圍內(nèi)均具有較高的尼古丁降解活性。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示適宜條件為：溫度30 ℃、起始pH 7.0、接種量10%及轉(zhuǎn)速180 r/min，尼古丁降解率可達(dá)91.53%。HPLC結(jié)果表明尼古丁的降解過程伴隨著不同中間產(chǎn)物的生成與消耗，揭示了ZUC-3的高效降解過程。本研究不僅為煙草工業(yè)廢棄物的生物治理提供新的微生物資源，而且也為其他毒素的生物降解及其工業(yè)化應(yīng)用提供新思路和線索。

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