姜瑾 朱蓉嶸 胡楠 周婧 楊梅 管懷進(jìn)

白內(nèi)障是世界范圍內(nèi)患者視力損害和致盲的最主要原因[1]。年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)是最為常見的白內(nèi)障類型，其發(fā)病率隨年齡升高而增加。因?yàn)槿蛉丝诶淆g化，ARC引起的致盲給全世界帶來越來越沉重的負(fù)擔(dān)[2]。ARC的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚。氧化損傷被視為晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LEC)凋亡的重要調(diào)控因素，且在ARC發(fā)病機(jī)制中起至關(guān)重要的作用[3-4]。最近的研究報(bào)道LEC中活性氧所致DNA損傷與ARC發(fā)病有關(guān)[5-7]。DNA氧化損傷的修復(fù)機(jī)制包括直接修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)、核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)以及雙鏈斷裂修復(fù)(double strand break repair，DSBR)[8-9]。根據(jù)功能劃分，ERCC6、WRN以及OGG1基因分別作用于NER、DSB以及BER途徑[10]。最近的報(bào)道指出HSF4也作用于DSB途徑[11]。有研究證實(shí)DNA修復(fù)基因的多態(tài)性與年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related degeneration，AMD)以及ARC的易感性有關(guān)[9-10]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)和拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)是兩種主要的遺傳變異類型。CNV與染色體重組以及一些遺傳疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，并且對人類抗病性和易感性等表型變異的影響至關(guān)重要[12]。目前，CNV已成為基因多態(tài)性研究的熱點(diǎn)，本課題組前期研究證實(shí)GSTT1基因的CNV與漢族人群對ARC的易感性有關(guān)[13]。

本研究從江蘇眼病研究中選擇ARC組和對照組，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測江蘇省漢族人群中四種DNA修復(fù)基因的CNV，探討DNA修復(fù)基因的CNV與ARC易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料臨床資料來源于江蘇眼病研究流行病學(xué)調(diào)查基地[2]，現(xiàn)場工作于2010年10月至2011年5月進(jìn)行。分為對照組525人和ARC組780例。ARC組入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)晶狀體混濁；(2)年齡≥50歲；(3)最佳矯正視力<20/40[14]；(4)沒有其他明確的導(dǎo)致白內(nèi)障的原因。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)青光眼、高度近視、葡萄膜炎、糖尿病、眼外傷以及其他原因引起的白內(nèi)障；(2)任何一眼為無晶狀體眼或者人工晶狀體眼；(3)以前接受過放射治療或者激素治療的患者。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，篩選出ARC患者，并根據(jù)LOCSⅢ分級系統(tǒng)對晶狀體混濁程度進(jìn)行分級[14-15]。ARC組包含皮質(zhì)性257例，核性368例，后囊下性34例以及混合性121例。

對照組與ARC組無親屬關(guān)系，均無ARC家族史。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)晶狀體透明；(2)最佳矯正視力均≥20/25。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴其他眼?。壕铙w脫位、青光眼、近視、黃斑病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及葡萄膜炎；(2)伴其他系統(tǒng)性疾?。禾悄虿?、腎病以及癌癥等。ARC組與對照組年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。本研究遵守赫爾辛基宣言，并通過南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，每一位受試者納入前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取用一次性真空采血管采集受試者外周靜脈血2 mL，20 g·L-1EDTA抗凝，混勻，-70 ℃恒溫凍存?zhèn)溆谩２捎梅?氯仿-異戊醇法提取外周血白細(xì)胞基因組的DNA，并通過Gene Quant 100紫外分光光度計(jì)測量DNA的濃度和純度。

1.2.2 基因CN的檢測運(yùn)用美國ABI公司的雙重RT-PCR CN分析方法檢測目的基因的CN。購買DNA修復(fù)基因的TaqMan CN探針，即FAM標(biāo)記探針，見表1。購買以VIC標(biāo)記的內(nèi)參基因探針，本研究中選擇RNaseP為CNV內(nèi)參基因(目前認(rèn)定在人類的各種細(xì)胞中，該基因都為兩個(gè)拷貝)。

表1 TaqMan CN探針信息

項(xiàng)目基因ERCC6WRNOGG1HSF4目標(biāo)變異號Variation_60013-Variation_115655Variation_114213探針序列號Hs01920803_cnHs06237156_cnHs01955678_cnHs02989737_cn染色體位置Chr10:50681070Chr8:30954001Chr3:9803327Chr.16:6719837染色體區(qū)段10q11.23a8p12d3p25.3c16q22.1a探針基因位置內(nèi)含子14-外顯子15內(nèi)含子 16內(nèi)含子6-外顯子6內(nèi)含子2-外顯子3

將所有樣本的DNA濃度稀釋至0.01 g·L-1。RT-PCR總反應(yīng)體系為10.0 μL，包含2×Taq Man PCR 反應(yīng)液5.0 μL，DNA模板2.0 μL，TaqMan CN探針0.5 μL，TaqMan CN內(nèi)參探針0.5 μL以及去離子水2.0 μL。

RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min后進(jìn)入反應(yīng)循環(huán)：95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)均重復(fù)3次。通過檢測PCR過程中PCR產(chǎn)物與相應(yīng)探針結(jié)合之后產(chǎn)生的熒光信號，比較目的基因和內(nèi)參基因的Ct值(threshold value)，以已知CN的人類基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，在CopyCaller 2.0軟件中用△△Ct值的方法計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對含量，分析目的基因的CN。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用Stata 10.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)比較ARC組和對照組間年齡和性別的差異。采用卡方檢驗(yàn)比較ARC組和對照組每個(gè)基因的CN類別(CN=0、1、2或者3+)的差異，其中CN=2的組為參考值組。Logistic回歸分析計(jì)算ARC組和對照組的相對危險(xiǎn)度(odds ratio，OR)及95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。如果最初的分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步將P值進(jìn)行多重校正，得出校正P(Pc)值。

2 結(jié)果

2.1 ARC組與對照組四種基因的CNV分析結(jié)果ARC組和對照組的WRN基因中，均發(fā)現(xiàn)了新的CNV。WRN基因高拷貝(CN=3+)與ARC的易感性有關(guān)(P=0.02)。HSF4基因低拷貝(CN=1)的人群對ARC易感(P=0.004)。然而，經(jīng)過多重校正后，WRN基因高拷貝對ARC的易感性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pc>0.05)，見表2。

2.2 四種基因的CNV與各亞型ARC易感性的關(guān)系WRN基因高拷貝與核性以及后囊下性ARC的易感性有關(guān)(均為P=0.02)。然而，經(jīng)過多重校正后發(fā)現(xiàn)，這種易感性并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pc>0.05)。HSF4基因低拷貝與核性以及后囊下性ARC的易感性有關(guān)(Pc=0.004、Pc=0.04)，見表3。

表2 ARC組與對照組四種基因的CNV

CNARC組[n(%)]對照組[n(%)]OR(95%CI)P/Pc值ERCC6 00(0)0(0)-- 17(0.9)7(1.3)0.68(0.24～1.96)0.48 2742(95.1)506(96.4)1.0(參考值)- 3+31(4.0)12(2.3)1.76(0.90～3.46)0.10WRN 01(0.1)1(0.2)0.69(0.04～11.08)0.79 14(0.5)4(0.8)0.69(0.17～2.78)0.60 2726(93.1)502(95.6)1.0(參考值)- 3+49(6.3)18(3.4)1.88(1.08～3.27)0.02/0.08OGG1 00(0)0(0)-- 110(1.3)5(1.0)1.35(0.46～3.98)0.58 2760(97.4)514(97.9)1.0(參考值)- 3+10(1.3)6(1.1)1.13(0.41～3.12)0.82HSF4 00(0)0(0)-- 129(3.7)5(1.0)4.09(1.57～10.63)0.004/0.016 2724(92.8)510(97.1)1.0(參考值)- 3+27(3.5)10(1.9)1.90(0.91～3.96)0.09

2.3 不同性別分組后四種基因的CNV與ARC易感性的關(guān)系WRN基因高拷貝與女性對ARC的易感性有關(guān)(P=0.03)。HSF4基因低拷貝與女性對ARC的易感性有關(guān)(P=0.01)。經(jīng)過多重校正后，僅HSF4基因低拷貝與女性對ARC的易感性有關(guān)(Pc=0.04)。WRN和HSF4基因的聯(lián)合作用與不同性別組對ARC易感性的關(guān)系，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3 ARC組與對照組CNV與各亞型ARC易感性的關(guān)系

CN對照組[n(%)]ARC組[n(%)]皮質(zhì)性(n=257)核性(n=368)后囊下性(n=34)混合性(n=121)ERCC6 00(0)0(0)0(0)0(0)0(0) 17(1.3)2(0.8)5(1.4)0(0)0(0) 2506(96.4)245(95.3)350(95.1)33(97.1)114(94.2) 3+12(2.3)10(3.9)13(3.5)1(2.9)7(5.8)WRN 01(0.2)0(0)1(0.3)0(0)0(0) 14(0.8)1(0.4)3(0.8)0(0)0(0) 2502(95.6)244(95.0)339(92.1)30(88.2)113(93.4) 3+18(3.4)12(4.7)25(6.8)?4(11.8)?8(6.6)OGG1 00(0)0(0)0(0)0(0)0(0) 15(1.0)2(0.8)5(1.4)1(2.9)2(1.7) 2514(97.9)251(97.7)358(97.3)32(94.1)119(98.3) 3+6(1.1)4(1.6)5(1.4)1(2.9)0(0)HSF4 00(0)0(0)0(0)0(0)0(0) 15(1.0)6(2.3)19(5.2)??2(5.9)??2(1.7) 2510(97.1)240(93.4)338(91.8)30(88.2)116(95.9) 3+10(1.9)11(4.3)11(3.0)2(5.9)3(2.5)

注：*P<0.05，Pc>0.05；**P<0.05，Pc<0.05，均為相應(yīng)ARC組與對照組相比較

表4 不同性別ARC組和對照組的CNV與ARC易感性的關(guān)系

CN男性ARC組[n(%)]對照組[n(%)]OR(95%CI)P/Pc值女性ARC組[n(%)]對照組[n(%)]OR(95%CI)P/Pc值WRN 00(0)1(0.4)0.26(0.01～6.37)0.261(0.2)0(0)1.91(0.08～47.14)0.43 12(0.6)3(1.3)0.52(0.09～3.12)0.462(0.4)1(0.3)1.27(0.11～14.12)0.84 2288(92.9)223(94.1)1.0(參考值)-438(93.2)279(96.9)1.0(參考值)- 3+20(6.5)10(4.2)1.55(0.71～3.38)0.2729(6.2)8(2.8)2.31(1.04～5.12)0.03/0.12HSF4 00(0)0(0)--0(0)0(0)-- 19(2.9)2(0.8)3.54(0.76～16.56)0.0920(4.3)3(1.0)4.33(1.27～14.70)0.01/0.04 2291(93.9)229(96.6)1.0(參考值)-433(92.1)281(97.6)1.0(參考值)- 3+10(3.2)6(2.5)1.31(0.47～3.66)0.6017(3.6)4(1.4)2.76(0.92～8.28)0.06

2.4 四種基因的CNV與ARC易感性的關(guān)系HSF4基因的CNV聯(lián)合作用與ARC的易感性有關(guān)(P=0.001)。WRN和HSF4基因的CNV聯(lián)合作用顯著增加了ARC的易感性，OR值從單純HSF4基因的2.63上升到聯(lián)合作用后的6.80。其他基因CNV的聯(lián)合作用與ARC的易感性均無關(guān)(均為P>0.05)，見表5。

表5 四種基因的CNV聯(lián)合作用與ARC易感性的關(guān)系

基因CN高拷貝或低拷貝ARC組[n(%)]對照組[n(%)]OR(95%CI)P/Pc值ERCC638(4.87)19(3.62)1.36(0.78～2.39)0.28WRN54(6.92)23(4.38)1.62(0.98～2.68)0.06OGG120(2.56)11(2.10)1.23(0.58～2.59)0.59HSF456(7.18)15(2.86)2.63(1.47～4.70)0.001/0.004ERCC6+WRN10(1.28)7(1.33)0.96(0.36～2.54)0.94ERCC6+OGG12(0.26)5(0.95)0.27(0.05～1.38)0.09ERCC6+HSF43(0.38)3(0.57)0.67(0.14～3.34)0.60WRN+OGG14(0.51)2(0.38)1.35(0.25～7.39)0.73WRN+HSF410(1.28)1(0.19)6.80(0.87～53.35)0.03/0.12OGG1+HSF45(0.64)3(0.57)1.12(0.27～4.72)0.87

3 討論

ARC的確切病因及發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。隨著基因測序的完成，SNPs以及CNV對ARC的影響已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究以“江蘇眼病研究”流行病學(xué)人群為研究對象，來探討DNA修復(fù)基因的CNV與ARC易感性的關(guān)系。由于特殊的地理背景和生活習(xí)慣，研究對象具有遺傳學(xué)上相對均質(zhì)的特點(diǎn)，克服了病例對照研究所存在的選擇偏倚，具有良好的可信性和代表性。本研究所得的基因多態(tài)性結(jié)果同時(shí)也反映其在中國漢族人群中的分布。

大多數(shù)CNV是穩(wěn)定的，并且可以遺傳。CNV引起的基因重組可能通過基因劑量效應(yīng)打斷基因，創(chuàng)造融合基因，施加位置影響，或者暴露一個(gè)有害的隱性突變來編碼致病性表型[16-18]。所以，CN增加不一定導(dǎo)致基因功能的增強(qiáng)，也可能會導(dǎo)致基因功能喪失。

DNA修復(fù)途徑的缺陷可能導(dǎo)致許多不同類型的疾病產(chǎn)生。WRN基因在DNA的損傷修復(fù)過程中起到重要的作用[19]。迄今為止，科學(xué)家們證實(shí)了WRN基因的SNPs與許多年齡相關(guān)性疾病有關(guān)，如心血管疾病以及某些癌癥[20-22]。在人類基因組變異數(shù)據(jù)庫上未見報(bào)道WRN基因存在CNV，但本研究發(fā)現(xiàn)了WRN基因的CNV。這個(gè)CNV仍需通過其他檢測方法，以及在其他人群中進(jìn)行驗(yàn)證。本研究還發(fā)現(xiàn)WRN基因高拷貝的人群容易患ARC。目前人晶狀體蛋白質(zhì)中WRN基因的正常表達(dá)尚未完全清楚[23]。因此，WRN基因CNV的功能性序列以及它對晶狀體蛋白質(zhì)表達(dá)的影響仍需要進(jìn)一步研究。

最近的研究證實(shí)HSF4基因與DNA的DSB途徑有關(guān)[11]。除此之外，HSF4基因編碼一系列的晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白，HSF4基因的突變導(dǎo)致這些蛋白的表達(dá)降低[24-25]。有報(bào)道顯示HSF4基因與部分漢族人對ARC的易感性有關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)HSF4基因低拷貝是ARC的易感因素。并且這種易感性在核性以及后囊下性ARC尤為明顯。DNA修復(fù)功能受損以及晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白的低表達(dá)可能與這種易感性有關(guān)。

CNV與核性以及后囊下性ARC的易感性密切相關(guān)可能是因?yàn)檠趸瘬p傷以及遺傳因素對不同種類的ARC所起的作用不同。有證據(jù)顯示氧化損傷對核性ARC的作用大于皮質(zhì)性以及后囊下性。此外，家族史被認(rèn)為是ARC的高危因素[27-28]，Hammond等[29]對雙胞胎的研究證實(shí)了核性ARC 48%與遺傳有關(guān)。本研究的研究對象來自江蘇眼病研究基地，總樣本量在流行病學(xué)調(diào)查階段就已經(jīng)確定了。在總樣本中，ARC組的構(gòu)成比較小，因此本研究中ARC組樣本量較少。這導(dǎo)致了不可避免的抽樣誤差。后續(xù)的流行病學(xué)調(diào)查工作中，本課題組將進(jìn)一步驗(yàn)證ARC組的試驗(yàn)結(jié)果。

全世界范圍內(nèi)都有報(bào)道女性的ARC患病率更高[30-31]。Vashist等[30]報(bào)道女性對ARC的易感性可能來源于一些內(nèi)在差異，如激素水平的不同。雌激素可能有預(yù)防ARC發(fā)生的作用。本研究提示HSF4基因單拷貝的女性更容易患ARC。雌激素水平的下降以及DNA修復(fù)能力的損傷可能協(xié)同作用，最終導(dǎo)致ARC的發(fā)生。

有研究報(bào)道ERCC6基因的SNPs與ARC以及AMD的易感性有關(guān)[32-33]。Zhang等[10]報(bào)道OGG1-Ser326Cys多態(tài)性與ARC的易感性有關(guān)。但是，本研究沒有發(fā)現(xiàn)ERCC6以及OGG1的CNV與ARC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。這可能是因?yàn)镋RCC6和OGG1的異常拷貝(CN≠2)個(gè)體相對而言比較罕見。

本研究發(fā)現(xiàn)，WRN與HSF4基因CNV的聯(lián)合作用可以提高罹患ARC的風(fēng)險(xiǎn)。ARC是一種復(fù)雜性疾病，它的發(fā)生可能不僅與一種CNV有關(guān)，多種CNV的聯(lián)合作用以及多種基因變異形式的聯(lián)合作用可能與ARC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，漢族人群中DNA修復(fù)基因的CNV與ARC的易感性有關(guān)。在將來的研究中，本課題組將進(jìn)一步探討這些CNV的功能序列以及它們影響表達(dá)的潛在機(jī)制，以期為ARC的針對性預(yù)防、診斷和基因治療提供理論依據(jù)。