克隆猴：我國在非人靈長類研究領(lǐng)域由國際“并跑”到“領(lǐng)跑”

孫強 宋杰

精子和卵子各攜帶一半遺傳物質(zhì)，相互結(jié)合在一起，形成受精卵并發(fā)育成一個新的個體，這是大家熟知的哺乳動物生殖方式，但體細胞克隆卻用“貍貓換太子”的手法，將一個體細胞里的染色體（即DNA）替換掉卵細胞中的DNA，再讓這個卵細胞用體細胞里的DNA完成新個體的孕育，其難度不言而喻。

自從1997年“多莉羊”體細胞克隆成功后，已有超過20種哺乳動物的克隆由全球多個生物醫(yī)學機構(gòu)相繼實現(xiàn)。其中，實驗小鼠是生命科學研究與新藥研發(fā)最重要的模式動物之一，為科學家發(fā)現(xiàn)生命奧秘、幫助人類研發(fā)新藥，立下了赫赫功勛。

不過，真正讓全世界頂尖科研團隊緊緊盯住的目標始終只有一個——猴。因為靈長類的進化跟人類非常接近，對認識人類的大腦、腦認知功能和腦疾病有非常大的潛在應(yīng)用價值。

21世紀初，美國匹茲堡大學的科研人員在《科學》上發(fā)文稱，用體細胞克隆非人靈長類動物的理想是不可能實現(xiàn)的。當時，俄勒岡大學教授米塔利波夫撰文指出，科學家更應(yīng)該從人跡罕至的科學道路上發(fā)現(xiàn)不尋常的風景。但在2011年，他在嘗試了15000枚猴卵細胞后失敗了：他制備的克隆猴在懷孕81天后流產(chǎn)。而這已是在這個領(lǐng)域取得的最好成績。

中國科學家能不能有所突破？能！中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學研究所）孫強研究員率領(lǐng)以博士后劉真為主的團隊，經(jīng)過5年的不懈努力，終于在國際上首次實現(xiàn)了非人靈長類動物的體細胞克隆。

2017年11月27日，世界上首個體細胞克隆猴“中中”在中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學研究所）的非人靈長類平臺誕生;12月5日第二個克隆猴“華華”誕生。該成果標志中國率先開啟了以體細胞克隆猴作為實驗動物模型的新時代，實現(xiàn)了我國在非人靈長類研究領(lǐng)域由國際“并跑”到“領(lǐng)跑”的轉(zhuǎn)變。

那么，這個里程碑式的轉(zhuǎn)變背后有什么故事？本文系中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心非人靈長類研究平臺主任孫強作為親歷者對我國在體細胞克隆猴從孕育到誕生全過程的回顧，并授權(quán)《中國經(jīng)濟周刊》刊發(fā)。

2001年，國外有了轉(zhuǎn)基因猴，當時中國不僅沒有轉(zhuǎn)基因猴，連試管猴也未見報道，而國外早在1984年就有了試管猴。

為了做出轉(zhuǎn)基因猴，我在博士畢業(yè)后，沒有選擇去國外做博士后，而是在2004年去了西雙版納的一座山上的養(yǎng)殖場開展猴生殖生理和轉(zhuǎn)基因猴構(gòu)建的研究。這個決定對于我來說并不容易，當時妻子孩子都在揚州，我兩個月才回一次家。盡管每次上山都要坐纜車，一周下山一次去買菜，我卻在這里待了將近4年。

經(jīng)過近4年的努力，雖然掌握了非人靈長類輔助生殖技術(shù)并得到了試管猴，但卻沒能得到轉(zhuǎn)基因猴。隨著原單位研究項目的結(jié)題，我繼續(xù)開展非人靈長類相關(guān)研究的科研條件也將失去。盡管我心里還一直惦記著自己熱愛并全身心投入的研究領(lǐng)域，但現(xiàn)實的困境逼迫我不得不考慮轉(zhuǎn)變科研方向。

幸運的是，2009年，恰逢中國科學院神經(jīng)科學研究所制定發(fā)展“路線圖”的階段性目標，計劃開辟能夠引領(lǐng)學科發(fā)展的、增強國際科技競爭力的、有應(yīng)用價值的非人靈長類研究領(lǐng)域，神經(jīng)所蒲慕明院士感受到了我內(nèi)心從事非人靈長類研究的強烈科研欲望，決定把建設(shè)非人靈長類研究平臺的重任交給我，我所熱愛的科研事業(yè)迎來了夢想中的春天。

來到神經(jīng)所后，考慮到從頭建設(shè)非人靈長類設(shè)施需要花費數(shù)年時間，我又一次選擇在一個遠離家鄉(xiāng)和核心城市，在位于太湖中一個小島上的猴場，通過租用設(shè)施來實現(xiàn)盡快起步。

在島上最初的交通工具是自行車和電瓶車，這方便我們?nèi)ユ?zhèn)上收取試劑和耗材等快遞包裹。如果我們要出島，主要坐69路公交，距離市區(qū)較遠，我們需要坐60站路大約2小時的車程才能到火車站。

早期島上沒有食堂，吃飯也是需要解決的問題，我們給每個宿舍都配備了廚房，大家輪流買菜做飯，到了節(jié)假日的時候還會組織一些集體聚餐，讓大家展示自己的廚藝，這樣既解決生活上的問題，又增進了同事之間的感情。在生活上，我們就像一家人;在工作中，實驗室就是我們的家。由于比較潮濕，實驗室一樓的墻壁發(fā)黃甚至發(fā)霉，員工就自發(fā)組織起來，利用空閑時間粉刷墻壁和天花板，美化家園。

2010年國慶假期的一個雨夜，在從基地返回宿舍沒有路燈的路上騎行時，我摔斷了鎖骨。但當時正是實驗的關(guān)鍵節(jié)點，且還沒有培養(yǎng)出能夠替代我的人，我只好懸著胳膊繼續(xù)干了一個星期。實驗做完再去醫(yī)治的時候，醫(yī)生發(fā)現(xiàn)摔斷的鎖骨已錯位，不得不重新切斷后再接上。

這樣的付出是值得的，2011年，我們成功得到了世界上首批攜帶人類自閉癥基因的猴模型;其后我們成功開發(fā)了實驗猴成熟加速技術(shù)，將食蟹猴的繁殖周期從5年以上縮短到2.5年;我們還建立了基于分子核酸酶的基因編輯猴模型構(gòu)建技術(shù)，這些工作對整個中國非人靈長類研究起到了推動作用。

但是，上述方法構(gòu)建的模型猴仍然存在首建動物嵌合、脫靶和遺傳背景不均一等問題。2012年我毅然接下了攻克非人靈長類體細胞克隆技術(shù)這一重任，試圖解決這些問題。

20多年來，國際上多個頂級實驗室都鎩羽而歸。世界公認的克隆專家米塔利波夫前后用了1.5萬枚猴卵，卻仍以失敗告終。國際上一度悲觀地認為體細胞克隆猴不可能成功。盡管如此，我和我的團隊還是冒著很可能失敗或很長時間沒有成果的風險，開始了體細胞克隆技術(shù)的攻關(guān)。

但我必須在前人失敗的基礎(chǔ)上思考如何攻關(guān)。體細胞克隆猴實驗做了5年，我的團隊也失敗了5年。深深的挫敗感時常使大家感到非常痛苦和沮喪。我也經(jīng)常勉勵大家，做最壞的打算，盡最大的努力。

在體細胞克隆猴技術(shù)具體操作上，主要有兩大難點。第一是拿掉細胞核的時候不能抽掉周圍太多營養(yǎng)物質(zhì)，否則細胞就會停止發(fā)育。此外，移植到卵細胞中的是成熟的、只表達某些特定基因的體細胞細胞核，研究人員需要想辦法讓它重新變成一個未分化的全能胚胎細胞。

由于猴子細胞不透明，在顯微鏡下看不到細胞核，需要通過偏振光才能把細胞核顯示出來。我們的研究人員注視著顯微鏡，在一閃一閃的偏振光下，操縱直徑10微米左右的極細針頭在細胞里吸取、注射，并盡可能減小對細胞的損傷，其難度遠大于操縱繡花針。最終，我們的團隊成員可以做到15秒內(nèi)實現(xiàn)體細胞注入操作，只有精湛的技術(shù)才可以保證對卵細胞損傷最小。

而在核基因組啟動前，體細胞核要經(jīng)歷一個回復到早期胚胎核狀態(tài)的過程，也就是“重編程”。只有將這個過程控制好，才能提高體細胞胚胎的發(fā)育率。

說個小故事。因為平臺的猴子是在室溫下養(yǎng)的，所以低溫或者酷暑的時候，大家都特別擔心。2016年抗洪救災(zāi)那一次，記得那是一個周末，神經(jīng)所每個小時都與我們聯(lián)系，包括晚上。星期天下午兩點，水位已經(jīng)很危險了，當時只能出人不能進人。所里領(lǐng)導擔心我們，他對我說：“儀器、猴子不用管了，你們趕快撤?！?/p>

但等我們再次通話時，我告知他儀器已經(jīng)搬回原處。他當時很驚訝，問我撤到哪里，可以如此快回來。我說：“撤的是女同胞，而男生都在那里等著?！敝挥袚碛羞@種熱愛集體、國家利益大于自己利益的精神，才會取得重大突破。

在嘗試各種調(diào)控方法效果均不理想后，2014年，我們在一篇報道中看到一種新的酶處理方法，并最終用這一方法將囊胚率提升到45%，優(yōu)質(zhì)胚胎率升高到29%。最終，我們用127枚卵母細胞，做了109個重構(gòu)胚胎，對21只猴子受體進行移植，獲得6只懷孕受體，最后只有兩只在2017年順利出生。

世界前沿難題的突破需要精干高效的攻關(guān)團隊?！爸就篮稀笔亲屛覀兡茉谝黄鹌床年P(guān)鍵。作為“隊長”的我，必須與團隊同甘共苦，而不是發(fā)號施令的“老板”，我和大家一起生活在基地，同吃同住。對新手，我會手把手地從零開始教，讓他們快速成長，同時培養(yǎng)他們的使命感、榮譽感和歸屬感。

在我的團隊，學位、出身都是虛浮之物，他們大多沒有光鮮奪目的背景，但經(jīng)過我們平臺的培訓和自己的大膽探索以后，他們都成為了“身懷絕技”的頂尖人才，在各自崗位上發(fā)揮著核心作用。正是大家“協(xié)同作戰(zhàn)”，才使得我們最終走向了成功。

2017年底，在歷盡5年艱辛后，終于有了回報，世界上首批體細胞克隆猴“中中”和“華華”順利誕生了，該工作也被評價為：“新的里程碑”式的突破。

大家對“中中”“華華”的名字非常感興趣，外媒也解讀“中華”的名字。

當時蒲慕明院士和我們團隊討論，如果這篇學術(shù)論文出去投稿，這兩個克隆猴寶寶應(yīng)該有名字，叫什么好呢？蒲院士看著我和劉真說：你們有“特權(quán)”，一人起一個，叫“強強”“真真”，寓意“真強”？我們二人幾乎同時搖頭，都說讓蒲院士起名字。

他想了一會兒，問“中華”如何？“中中”“華華”。我們齊聲說好！雖然起名字只有幾分鐘，但后來想想，中華復興夢在大家心里已經(jīng)藏了很久。

克隆猴體細胞的成功得益于天時、地利、人和，缺一不可。

掌握了體細胞克隆猴的技術(shù)只是開始，接下來我們會組織更多的力量，盡早研制出國際上首批用體細胞克隆猴技術(shù)研發(fā)的疾病模型猴和工具猴。

展望未來，我們將再接再厲，在體細胞克隆猴領(lǐng)域不斷產(chǎn)生原創(chuàng)性的重大突破，搶占國際上疾病克隆猴模型發(fā)展的先機，力爭在世界上最先獲得阿爾茨海默病、帕金森綜合征等腦疾病的克隆猴模型，為腦疾病的機理研究、干預(yù)、診治貢獻自己的力量。

此外，我們也將積極探索相關(guān)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，推動我國率先發(fā)展出基于非人靈長類疾病動物模型的全新醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，推進重大腦疾病、免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進程，為人類的健康和中國經(jīng)濟發(fā)展貢獻力量。

2019年1月，孫強團隊與同屬于中科院腦智中心的張洪鈞團隊合作，再獲佳績：在利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建世界首批核心節(jié)律基因BMAL1敲除獼猴模型的基礎(chǔ)上，孫強團隊通過一只癥狀最明顯的公猴的體細胞克隆出5只小猴。這項進展說明，中國科學家已可以批量生產(chǎn)遺傳背景均一的疾病獼猴模型。