李國平 楊鷺生

摘要：目的：建立寒蘭離體培養(yǎng)再生體系，為寒蘭種質(zhì)資源保護(hù)和工廠化育苗工作提供科學(xué)依據(jù).方法：以寒蘭假鱗莖作為外植體，比較不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對根狀莖誘導(dǎo)的影響，同時探究不同復(fù)硝酚鈉濃度、不同基本培養(yǎng)基和不同有機添加物等因素對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響.結(jié)果：根狀莖誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 1mg/L+NAA 5mg/L+蔗糖30g/L+活性炭3g/L+香蕉100g/L，根狀莖誘導(dǎo)率達(dá)40.5%;根狀莖增殖與分化的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+椰子汁10%+蔗糖30g/L，分化率達(dá)98.2%.結(jié)論：通過寒蘭假鱗莖側(cè)芽誘導(dǎo)根狀莖形成，篩選出寒蘭根狀莖誘導(dǎo)、增殖與分化的最適培養(yǎng)基，從而建立了穩(wěn)定、高效的寒蘭離體培養(yǎng)再生體系.

關(guān)鍵詞：寒蘭;根狀莖;誘導(dǎo);分化;植株再生

中圖分類號：Q813.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? 文章編號：1673-260X（2019）08-0026-04

寒蘭（Cymbidium kanran）屬蘭科蘭屬植物，主要分布在福建、江西、浙江、廣西、湖南、四川、云南以及貴州等地[1].寒蘭的表型性狀變異顯著、多樣性豐富，具有很高的觀賞和經(jīng)濟價值[2].武夷山脈寒蘭資源豐富，是全國寒蘭主要產(chǎn)區(qū)，但由于野生寒蘭遭到人為濫采，寒蘭資源日漸減少.野生寒蘭自然繁殖系數(shù)低，而且寒蘭相對于春蘭、建蘭、墨蘭等國蘭而言較難馴化栽培，下山寒蘭馴化栽培的成功率較低，致使許多寒蘭品種流失.更有一些商家大量收購下山寒蘭，寒蘭種質(zhì)資源破壞和流失情況嚴(yán)重，為此，有必要開展寒蘭組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究.目前，已有一些關(guān)于寒蘭組織培養(yǎng)以及快繁技術(shù)的研究報道[3-7]，朱國兵等以種子萌發(fā)后形成的根狀莖為外植體建立了相應(yīng)的離體快繁技術(shù)[4，5];張?zhí)煜璧纫院m莖尖為外植體進(jìn)行寒蘭組織培養(yǎng)技術(shù)體系的研究[6];蘇妍[7]及徐曉薇等[8]以寒蘭雜交種子為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得寒蘭再生植株.總體上說，寒蘭組織培養(yǎng)方面的研究成果甚少，缺乏較為高效穩(wěn)定的植株再生系統(tǒng)，有必要進(jìn)一步研究寒蘭的組培與快速繁殖技術(shù)問題.以寒蘭假鱗莖為外植體，通過誘導(dǎo)假鱗莖側(cè)芽形成根狀莖的研究還未見報道.本研究以寒蘭的假鱗莖為外植體誘導(dǎo)形成根狀莖，通過根狀莖增殖與分化影響因素的研究建立寒蘭高效的組織培養(yǎng)快繁體系，旨在為寒蘭資源的保護(hù)和可持續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為寒蘭（Cymbidium kanran）假鱗莖，取自武夷山下山細(xì)葉寒蘭成熟株.

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇與滅菌

每年3月至4月，選擇生長健壯、無病蟲害的成年植株，剪取假鱗莖作為外植體.將假鱗莖上的根、包葉和鱗片小心摘除，用洗衣液清洗干凈后置于燒杯中，在自來水下用緩水流沖洗12h.在超凈工作臺上，用添加了2-3滴吐溫80的0.1% HgCl2溶液浸泡20min（也可以根據(jù)外植體的幼嫩情況適當(dāng)增減浸泡時間），菌水沖洗4-5次，備用.

1.2.2 根狀莖誘導(dǎo)培養(yǎng)

將滅菌后的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基：（1）1/2 MS+TDZ（苯基噻二唑基脲-Thidiazuron）2mg/L+NAA 0.5mg/L;（2）1/2 MS+KT-30（吡效隆-Forchlorfenuron）2mg/L+NAA 0.5mg/L;（3）1/2 MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5mg/L;（4）1/2 MS+6-BA 0mg/L+NAA 5mg/L;（5）1/2 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 5mg/L;（6）1/2 MS+6-BA 1mg/L+NAA 5mg/L;（7）1/2 MS+6-BA 2mg/L+NAA 5mg/L.每處理接種9瓶，每瓶接種3個外植體，90d后觀察統(tǒng)計結(jié)果.上述培養(yǎng)基均添加蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，pH值5.8，（4）～（7）號培養(yǎng)基另添加活性炭3g/L、香蕉100g/L.培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間為14h/d，光照強度為1000～1500lx.

1.2.3 根狀莖的增殖與分化

將誘導(dǎo)形成的根狀莖切割下來，接種到根狀莖增殖與分化培養(yǎng)基（8）～（19）中培養(yǎng)，其中，（8）～（11）培養(yǎng)基研究不同濃度復(fù)硝酚鈉對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響，（12）～（15）培養(yǎng)基比較不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響，（16）～（19）培養(yǎng)基比較不同有機添加物對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響.以上每處理接9瓶，每瓶接3小叢根狀莖，共接18小叢，120d后統(tǒng)計結(jié)果.培養(yǎng)條件與1.2.2同.

增殖與分化培養(yǎng)基為：

（8）1/2 MS+復(fù)硝酚鈉0mg/L+NAA 0.25mg/L

（9）1/2 MS+復(fù)硝酚鈉0.5mg/L+NAA 0.25mg/L

（10）1/2 MS+復(fù)硝酚鈉0.75mg/L+NAA 0.25mg/L

（11）1/2 MS+復(fù)硝酚鈉1.0mg/L+NAA 0.25mg/L

（12）1/2 MS+S-3307（優(yōu)康唑-uniconazole）0.75 mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L

（13）B5+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5 mg/L

（14）N6+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L

（15）WPM+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L

（16）1/2 MS+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+10%香蕉泥

（17）1/2 MS+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+10%土豆汁

（18）1/2 MS+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+10%蘋果汁

（19）1/2 MS+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+10%椰子汁

以上培養(yǎng)基均添加蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，pH值5.8.

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法

誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出根狀莖的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%;增殖系數(shù)=增殖后的總數(shù)/接種總數(shù);分化率（%）=分化苗數(shù)/接種總數(shù)×100%.試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計及差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度對寒蘭根狀莖誘導(dǎo)的影響

將消毒滅菌后的假鱗莖分別接種在（1）～（7）培養(yǎng)基上，結(jié)果如表1.

寒蘭假鱗莖在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)反應(yīng)不同，（1）～（3）號培養(yǎng)基時僅誘導(dǎo)側(cè)芽的伸長生長（圖1-a，b），對側(cè)芽的誘導(dǎo)效果TDZ>KT-30>6-BA，但無根狀莖的形成.（4）號培養(yǎng)基中僅添加NAA，外植體稍膨大后死亡;一定質(zhì)量濃度6-BA與NAA配比可誘導(dǎo)根狀莖形成，（5）～（7）號培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度6-BA對根狀莖誘導(dǎo)率有極顯著影響（p<0.01），當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1mg/L時假鱗莖上側(cè)芽先萌動伸長（圖1-c），后期側(cè)芽停止伸長，而從其基本形成簇生根狀體（圖1-d），根狀莖誘導(dǎo)率達(dá)40.5±5.14%，因此，（6）號培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 1mg/L+NAA 5mg/L+蔗糖30g/L+活性炭3g/L +香蕉100g/L最適合寒蘭根狀莖誘導(dǎo).

2.2 不同復(fù)硝酚鈉濃度對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響

本研究以（8）號培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.25mg/L為對照，比較添加不同質(zhì)量濃度復(fù)硝酚鈉對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響，實驗結(jié)果表明：低濃度復(fù)硝酚鈉對根狀莖增殖與分化有顯著促進(jìn)作用（p<0.05），（9）（10）號培養(yǎng)基中根狀莖有一定增殖與分化，但芽生長較弱，且無根的形成.添加復(fù)硝酚鈉質(zhì)量濃度0.75mg/L的（10）號培養(yǎng)基中既有不定芽的形成，又有不定根的生成，其形態(tài)正常（圖2-a），分化率達(dá)65.0±5.86%;（11）號培養(yǎng)基中復(fù)硝酚鈉質(zhì)量濃度達(dá)1.0mg/L，對寒蘭根狀莖增殖和分化有負(fù)作用，分化率僅為34.5±3.04%（圖2-b）.所以，對于寒蘭根狀莖分化形成再生植株，培養(yǎng)基中復(fù)硝酚鈉適宜添加量為0.75mg/L.

2.3 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響

不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對寒蘭根狀莖增殖與分化有極顯著的影響（p<0.01）（表2），1/2 MS對根狀莖增殖與分化的效果顯著優(yōu)于B5、N6和WPW（圖3-a）.B5與N6培養(yǎng)基中根狀莖增殖較快，但不定芽分化少，且大都不能正常發(fā)育成苗（圖3-b，c）.非常有趣的是（15）號培養(yǎng)基中僅有不定根的分化，不定根粗壯、肉質(zhì)，發(fā)育快且形態(tài)正常（圖3-d）.通過篩選，確定適宜寒蘭根狀莖增殖與分化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2 MS.

2.4 不同有機添加物對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響

寒蘭根狀莖在（16）～（19）號培養(yǎng)基上生長發(fā)育狀況有所不同，有機添加物種類對寒蘭根狀莖的影響增殖與分化有顯著影響（p<0.05）.根狀莖在（17）（18）號培養(yǎng)基中的培養(yǎng)反應(yīng)相似，添加土豆汁、蘋果汁有助于根狀莖的增殖和不定根分化，而不利于不定芽分化（圖4-a）;添加香蕉泥的（16）號培養(yǎng)基中根狀莖增殖速度中等，形態(tài)正常，且不定芽與不定根同步發(fā)育，形成正常再生植株（圖4-b）.添加椰子汁的（19）號培養(yǎng)基中根狀莖的增殖與分化情況明顯優(yōu)于其它三種，根狀莖增殖速度較快，且不定芽與不定根同步分化，分化率達(dá)98.2±8.81%，再生植株形態(tài)正常（圖4-c、d）.

3 討論

寒蘭屬于國蘭.與洋蘭比，國蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)體系相對較難建立.朱國兵曾以寒蘭種子萌發(fā)后形成的根狀莖為外植體建立寒蘭快速繁殖技術(shù)[4]，張?zhí)煜枰院m莖尖為外植體[6]、徐曉薇以新芽為外植體進(jìn)行寒蘭組織培養(yǎng)技術(shù)體系的研究，并獲得再生植株[8].本研究以寒蘭假鱗莖為外植體誘導(dǎo)形成根狀莖，通過根狀莖增殖與分化獲得再生植株，其快繁技術(shù)體系與前人報道的有所不同.通過種子無菌培養(yǎng)再生的試管苗不能保持母本遺傳性狀，而以假鱗莖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)再生的試管苗保持了母本遺傳性狀，這對于寒蘭種質(zhì)資源的保存和優(yōu)良品種的快速繁殖與推廣具有重要意義.

本實驗通過篩選確定最適合寒蘭根狀莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 1mg/L+NAA 5mg/L+蔗糖30g/L+活性炭3g/L+香蕉100g/L.初步研究了基礎(chǔ)培養(yǎng)基、復(fù)硝酚鈉和有機添加物對寒蘭根狀莖增殖與分化的影響.復(fù)硝酚鈉是一種新型的人工合成植物生長調(diào)節(jié)劑，對促進(jìn)種子萌發(fā)、提高幼苗生長質(zhì)量及改善果實品質(zhì)等有良好效果[10，11].雖然實驗觀察到添加一定質(zhì)量濃度的復(fù)硝酚鈉對寒蘭根狀莖增殖與分化有一定促進(jìn)作用，但誘導(dǎo)形成的芽苗質(zhì)量和分化率不及（12）（16）和（19）號培養(yǎng)基.1/2 MS確定為適宜寒蘭根狀莖增殖與分化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，此研究結(jié)果與其它報道相同[5，6].通過不同有機添加物比較實驗，篩選出適宜寒蘭根狀莖增殖與分化的培養(yǎng)基為1/2 MS+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.5mg/L+椰子汁10%+蔗糖30g/L.

以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的（15）號培養(yǎng)基中僅有不定根的分化，此結(jié)果可為研究寒蘭不定根的生長發(fā)育提供理想研究系統(tǒng).WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基是根據(jù)MS培養(yǎng)基改良，屬低鹽培養(yǎng)基，一般適用于木本植物的組織培養(yǎng)[9].不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基和不同激素組合對寒蘭根狀莖增殖與分化的調(diào)控機制有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

以寒蘭假鱗莖為外植體，建立了穩(wěn)定、高效的寒蘭離體培養(yǎng)再生體系.根狀莖誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 1mg/L+NAA 5mg/L+蔗糖30g/L +活性炭3g/L+香蕉100g/L，根狀莖誘導(dǎo)率達(dá)40.5%;根狀莖增殖與分化的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+S-3307 0.75mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+椰子汁10%+蔗糖30g/L，分化率達(dá)98.2%.

——————————

參考文獻(xiàn)：

〔1〕吳應(yīng)祥.中國蘭花[M].北京：中國林業(yè)出版社，1991.50-51.

〔2〕段艷皊，范義榮，敖素燕，等.寒蘭種質(zhì)資源表型性狀多樣性分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30（16）：143-147.

〔3〕Lee J S. Shim K K.、YOO M S. et al. Studies on rhizome growth and organogenesis of Cymbidium Kanran cultured in vitro.J Korean Soc Hortic Sci. 1986， 27（2）：174-180.

〔4〕朱國兵，楊柏云，敖愛艷.寒蘭的組織培養(yǎng)與試管開花[J].植物生理學(xué)通訊，2008，44（03）：513-514.

〔5〕朱國兵，楊柏云，蔡奇英，等.寒蘭的快速繁殖技術(shù)[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2006，14（02）：151-156.

〔6〕張?zhí)煜?寒蘭組織培養(yǎng)體系研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2011.

〔7〕蘇妍.寒蘭雜交后代快速繁殖體系及生理生化研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2016.

〔8〕徐曉薇，柴明良，楊燕萍，等.寒蘭雜交及種子離體萌發(fā)研究[J].園藝學(xué)報，2011，38（10）：2010-2016.

〔9〕陳振光.園藝植物離體培養(yǎng)學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.182-187.

〔10〕劉興宇.新型植物生長調(diào)節(jié)劑復(fù)硝酚鈉及其應(yīng)用[J].農(nóng)藥市場信息，2007（14）：35，44.

〔11〕王雪麗，李萍萍，吳坤陽，等.日本五針?biāo)舍樔~胚性愈傷誘導(dǎo)及愈傷組織細(xì)胞[J].植物生理學(xué)報，2017，53（03）：422-428.