鈕松召 崔穎 盧菲 徐鵬程 孫超

摘 要 目的：建立蒙藥山川柳的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和聚類(lèi)分析。方法：采用HPLC法，色譜柱為Agilent ODS C18，流速為1.0 mL/min，流動(dòng)相為甲醇-水（梯度洗脫），檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。以槲皮素峰為參照，生成10批藥材樣品的HPLC指紋圖譜；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰；采用SPSS 17.0 軟件對(duì)10批藥材樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果：10批藥材樣品的HPLC指紋圖譜有13 個(gè)共有峰，相似度大于0.95，并指認(rèn)了槲皮素和山柰酚這2個(gè)共有峰。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，10批藥材樣品可聚為兩類(lèi)，S8聚為一類(lèi)，其余批次聚為一類(lèi)。結(jié)論：所建HPLC指紋圖譜、相似度評(píng)價(jià)和聚類(lèi)分析結(jié)果可為山川柳藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 山川柳；高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度；聚類(lèi)分析

Establishment of HPLC Fingerprint of Mongolian Medicine Ramulus Tamarix and Similarity Evaluation and Cluster Analysis

NIU Songzhao1，CUI Ying1，LU Fei1，XU Pengcheng1，SUN Chao2（1. College of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China； 2. Dept. of Pediatric Orthopaedics， the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010030， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Mongolian medicine Ramulus Tamarix， and to conduct similarity evaluation and cluster analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent ODS C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 335 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using quercetin peak as reference， HPLC fingerprint of 10 batches of medicinal sample were drawn. Similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2004 A） so as to confirm common peak. SPSS 17.0 software was used for cluster analysis of those samples. RESULTS： There were 13 common peaks in HPLC fingerprint of 10 batches of samples， and the similarities of them were all greater than 0.95； 2 common chromatographic peaks of quercetin and kaempferol were identified. Results of cluster analysis showed that 10 batches of samples were classified into 2 classes. S8 was clustered into one class； other were clustered into another class. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and results of similarity evaluation and cluster analysis can provide reference for quality control of R. Tamarix.

KEYWORDS Ramulus Tamarix； HPLC； Fingerprint； Similarity； Cluster analysis

山川柳（Ramulus Tamarix.）系檉柳科（Tamaricaceae）植物，蒙藥名為蘇海，別名為奧恩布，其藥用部位為嫩枝葉。山川柳作為蒙藥傳統(tǒng)藥材，性涼，味澀、甘，具有清熱、透疹、斂毒等作用[1] 。其主要含檉柳酚、檉柳酮、檉柳醇、總黃酮二甲醚、三十二烷醇己酸酯等化學(xué)成分[2-3]，臨床上用于治療小便不通暢、麻疹不透、皮膚癢疹、慢性風(fēng)濕病等[2，4]。

山川柳又稱(chēng)西河柳[5]，在2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中西河柳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有理化鑒別、薄層色譜鑒別及水分、灰分檢查等項(xiàng)目[6]。在《蒙藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究》中也僅記載了其來(lái)源、名稱(chēng)、性狀、水分、灰分及浸出物測(cè)定等[7]，但鮮見(jiàn)對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步研究，也未見(jiàn)其指紋圖譜研究的報(bào)道。為此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了10批山川柳藥材樣品的指紋圖譜，以完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó) Agilent公司）；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；JA5003N型千分之一電子天平（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.2 試劑

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-201608，純度：98%）、山柰酚對(duì)照品（批號(hào)：110861-201610，純度：98%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，美國(guó)Fi- sher公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

10批山川柳藥材（內(nèi)蒙古天立藥業(yè)公司，批號(hào)：20150408、20150509、20160308、20160609、20160808、20161009、20161208、20170209、20170508、20170708，編號(hào)：S1～S10），經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥用植物教研室喬俊纏教授鑒定為檉柳科（Tamaricaceae）檉柳屬（Tamarix Linn.）山川柳（Ramulus Tamarix.）的枝葉。藥材經(jīng)粉碎后過(guò)20目篩，于干燥陰涼處保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ODS C18（250 mm×4.6 mm ，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；洗脫時(shí)間：75 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品1.06 mg、山柰酚對(duì)照品1.51 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得單一對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述各單一對(duì)照品貯備液3、2 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得混合對(duì)照品溶液，避光保存。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末2.0 g，精密稱(chēng)定，置于雞心瓶中，加90%乙醇40 mL、3%鹽酸10 mL ，于70 ℃回流提取1.5 h。取出，放至室溫，濾過(guò)，加90%乙醇定容于50 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S5）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以槲皮素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S5）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以槲皮素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取藥材樣品粉末（編號(hào)：S5）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以槲皮素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)10批藥材樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版），以樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批藥材樣品相似度在0.951～1之間，均大于0.95，表明藥材樣品化學(xué)成分一致性較高，穩(wěn)定性較好，詳見(jiàn)表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 10批藥材樣品共有13個(gè)共有峰，其峰面積合計(jì)占色譜峰總面積的90%以上，詳見(jiàn)表3。通過(guò)與混合對(duì)照品的HPLC圖（見(jiàn)圖3）對(duì)比，指認(rèn)8號(hào)峰為槲皮素，10號(hào)峰為山柰酚。由于槲皮素（8號(hào)峰）色譜峰的峰面積穩(wěn)定、保留時(shí)間適中，且峰形較好，故以槲皮素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其他峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表4、表5。

2.5 聚類(lèi)分析

以各共有峰峰面積為變量，采用SPSS 17.0 軟件，以Ward法結(jié)合平方歐式距離對(duì)10批藥材樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，詳見(jiàn)圖4。由圖4可知，10 批藥材樣品可聚為兩類(lèi)，S8聚為一類(lèi)，其余批次聚為一類(lèi)。

3 討論

筆者前期參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-14]，比較了以甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%醋酸水溶液、甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)的色譜峰情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸的濃度及種類(lèi)對(duì)色譜峰形和出峰個(gè)數(shù)等影響不大。以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰形尖銳對(duì)稱(chēng)，基線(xiàn)較平穩(wěn)，不易漂移，出峰個(gè)數(shù)多且穩(wěn)定，有利于指紋圖譜的分析，故選擇甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。筆者又通過(guò)考察260、295、335、340、355 nm等不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm時(shí)，色譜峰的分離度大于1.0，出峰個(gè)數(shù)多，故選擇335 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

筆者通過(guò)比較超聲提取和回流提取兩種提取方式對(duì)提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取時(shí)的分離效果較好，峰形對(duì)稱(chēng)，峰面積較大，分離度適中，故選擇回流提取。此外，筆者還比較了以乙醇、甲醇為提取溶劑時(shí)對(duì)峰形的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以?xún)煞N提取溶劑所獲峰形差別不大，但考慮到乙醇毒性更小，故選擇乙醇為提取溶劑；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，90%乙醇與無(wú)水乙醇無(wú)明顯差異，為了節(jié)省成本，故最終選擇90%乙醇為提取溶劑。

10批藥材樣品共有13個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中2個(gè)共有峰，分別為槲皮素、山柰酚。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，10批藥材樣品的化學(xué)成分整體上一致性較高，但峰面積RSD差異較大，各批藥材樣品含量存在一定的波動(dòng)性。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，10批藥材樣品可聚為兩類(lèi)，S8聚為一類(lèi)，其余批次聚為一類(lèi)，但考慮到相似度均大于0.95，可認(rèn)為S8藥材樣品的化學(xué)成分與其他9批藥材樣品的化學(xué)成分有較高的一致性，只是受產(chǎn)地、氣候、生長(zhǎng)環(huán)境和采收時(shí)間等因素影響而產(chǎn)生一定的波動(dòng)。

綜上所述，本文所建立HPLC指紋圖譜、相似度評(píng)價(jià)和聚類(lèi)分析結(jié)果可為山川柳藥材的質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2018-11-12 修回日期：2019-02-23）

（編輯：陳 宏）