曾祥玲 章曉琴 鄒晶晶 王彩云

摘 要： 桂花是我國重要的傳統(tǒng)名花香花植物，花色與花香是桂花兩個重要的觀賞品質，受開花進程的影響。為了解其開花進程中色與香的合成過程及相關分子基礎，該研究利用不同花期的桂花花瓣和幼葉建立了適用于多個樣本的cDNA-AFLP體系，并分析開花進程中基因的表達差異。結果表明：共獲得了283個在花瓣中特異且差異表達的轉錄衍生片段（transcript-derived fragments， TDFs）。其中，120個TDFs 在數據庫中無同源序列;12個有同源序列，但功能未知;150個已知生物學功能的序列，其主要功能包括次級代謝、初級代謝和發(fā)育過程等。對其中已知功能的6個TDFs進行qRT-PCR驗證，4個轉錄水平較高的TDFs表達模式與AFLP分析結果基本一致。這對了解開花進程中桂花色與香的合成過程相關基因的表達奠定了基礎，也為進一步研究桂花色香形成的分子機制提供了參考。

關鍵詞： 桂花， cDNA-AFLP， 轉錄衍生片段， 花色， 花香

中圖分類號： Q943 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2019）07-0940-11

Abstract： Osmanthus fragrans is an important traditional fragrant flower in China. Floral color and scent as the important ornamental characters are influenced by flowering process. Reports on the components of floral color and scent and related synthetic genes have been reported. However， studies on the synthesis and molecular basis of floral color and scent during flowering process are rarely reported. The study established a cDNA-AFLP system suitable for multiple samples and analyzed genes differential expression at different flowering stages. Finally， 283 TDFs with specific expression in petals and differential expression during flowering were successfully cloned and sequenced. Public databases blast showed that 120 TDFs had no homologous sequences， 12 TDFs had homologous sequences but their functions were unknown， and 150 TDFs had known biological functions， including the secondary metabolism， primary metabolism and development process， ect. qRT-PCR results of 6 TDFs with known functions comparing with cDNA-AFLP displayed that 4 TDFs with higher transcriptional level had consistent expression level. These results would be helpful to understand the gene expression of petals during flowering processes， and provide useful information for exploiting the mechanism of the floral color and scent formation of O. fragrans from molecular level.

Key words： Osmanthus fragrans， cDNA-AFLP， transcript-derived fragments， floral color， floral scent

桂花（Osmanthus fragrans）是我國十大傳統(tǒng)名花之一，作為重要的香花植物被廣泛應用于園林綠化、食品加工、精油及天然色素提取等領域（向其柏和劉玉蓮，2008;楊康民，2012）。前人報道了桂花花香成分主要是萜類、酯類、醇類、酮類和醛類等（Xin et al.， 2013;Cai et al.， 2014），花色成分主要是類胡蘿卜素和黃酮類化合物（蔡璇等，2010;侯丹，2014;Han et al.， 2014）。與花香和花色合成相關的基因也逐漸被挖掘，如CCDs、TPSs等（Huang et al.， 2009;Baldermann et al.， 2010;曾祥玲等，2016）?；ò晔腔ㄏ愫突ㄉ镔|合成的主要組織部位，而且在不同發(fā)育時期花瓣中，花香和花色物質的合成速率不同（Dudareva et al.， 2013;Tanaka et al.， 2008）。在桂花中，花香與花色的物質合成隨著花朵的開放顯著增加，盛花期之后又逐漸下降（Zeng et al.， 2015;曾祥玲等，2016;鄒晶晶等，2017）。目前，有關開花進程中桂花色與香的合成過程及相關分子基礎的研究報道卻很少。

由于桂花目前無基因組報道，開花過程的轉錄組研究也無參考，因此限制了開花進程中桂花色香形成分子基礎研究的進一步深入。cDNA-AFLP技術是由Bachem et al. （1996）將擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism， AFLP）技術應用于mRNA表達差異分析的一種mRNA指紋圖譜技術。該技術的優(yōu)點是成本較低、無需預知序列信息、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高、可對生物體轉錄組進行全面系統(tǒng)的分析，目前在海棠、文心蘭、菊花等觀賞植物的基因差異表達研究中已成功運用（李志紅等，2008;龔茂江等，2011;Huang et al.， 2012）。張園（2009）和Han et al.（2015）利用cDNA-AFLP分別比較了‘銀桂’鈴梗期和盛花初期、盛花期‘銀桂’和‘丹桂’花瓣的基因表達差異，分別獲得50和102個差異表達的基因片段（transcript-derived fragments，TDFs）。冷春旭等（2007）以不同發(fā)育時期的愈傷組織為材料，利用cDNA-AFLP對陸地棉體細胞胚胎發(fā)生過程中的基因差異表達進行了分析，找到了與胚胎發(fā)育有關為胚性愈傷所特有的差異條帶，這表明cDNA-AFLP能將多個樣品同時進行比較分析。

本研究通過mRNA分離、限制性內切酶和選擇性擴增引物組合的篩選，建立了桂花中多個樣本的cDNA-AFLP體系;并利用該體系同步分析‘柳葉金桂’葉片以及6個不同開花時間花瓣的轉錄組，從中獲得花瓣中特異表達且各花期差異表達的轉錄衍生片段（transcript-derived fragments， TDFs）。從而挖掘開花進程中影響桂花色香形成的相關基因，為進一步揭示桂花色香形成的分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用植物材料為華中農業(yè)大學校園苗圃內光照均勻且無病蟲害的健康植株桂花品種‘柳葉金桂’（Osmanthus fragrans ‘Liuye jingui’），其花瓣發(fā)育時期參考Zou et al.（2014）的劃分，花瓣發(fā)育時期對應的具體取樣時間如圖1所示：（1）鈴梗期，花朵未展開，花瓣呈緊閉的花苞狀（time=0 d）;（2）初花期，花朵半開放，花瓣微張（time=2 d）;（3）盛花期，花朵完全展開，直徑到達最大，且無褐色斑點（time=4 d 和6 d）;（4）盛花末期，花瓣出現褐色斑點，且出現一定程度脫落（time=8 d）。幼葉于5月采取;花瓣于當年10月份采取，自鈴梗期開始，每隔2 d取樣一次，除初花期（time=2 d）分別于上午10：00 和下午5：00進行兩次取樣外，其余取樣時期均統(tǒng)一為上午10：00左右。對取樣材料稱重后立即置于液氮中速凍，盡快轉移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 取適量花瓣或葉片樣品用液氮進行研磨，參考Trizol試劑盒方法（CoWin Biotech Co.， Ltd， Beijing. China）提取樣品總RNA。RNA的完整性和濃度分別利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 （Thermo公司）微量分光光度計進行檢測。采用OligotexTM-dT30mRNA 純化試劑盒（Takara 公司）進行mRNA分離。之后，參考RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）說明書合成雙鏈cDNA。

1.2.2 雙鏈cDNA的酶切 本實驗選用兩組限制性內切酶組合，分別為 FastDigest EcoR I和FastDigest Mse I組合、FastDigest Taq I 和FastDigest Ase I組合，以篩選更好的組合。EcoR I/Mse I組合的反應程序：37 ℃ 30 min，65 ℃ 5 min，80 ℃ 5 min 滅活;Ase I/Taq I組合的反應程序為37 ℃ 30 min，65 ℃ 30 min，然后用氯仿抽提滅活。

1.2.3 cDNA-AFLP分析 AFLP分析步驟參考Bachem et al.（1996）。利用T4 DNA連接酶（Fermentas 公司）對酶切后的cDNA分別進行接頭連接，然后分別利用EcoR00/Mse00和Ase00/T00引物進行PCR預擴增，取5 μL的預擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。對合適的預擴增產物進行50×稀釋，之后利用16條EcoRⅠ引物和16條MseⅠ引物組成256對引物組合進行選擇性擴增。引物見表1。選擇性擴增反應總體積為20 μL，包含1 μL模板，EcoRⅠ和MseⅠ選擇性擴增引物 （10 μmol·L-1） 各1 μL，10 μL 2× DreamTaq PCR Master Mix（Fermentas 公司）;擴增反應條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 變性30 s，65 ℃ （每個循環(huán)遞減0.7 ℃）退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，12個循環(huán);95 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 1 min，25個循環(huán);72 ℃ 終延伸5 min。擴增產物經6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離得到差異表達片段。

1.2.4 差異TDFs回收、克隆和序列分析 用鋒利刀片將膠板上的目的片段切割下來，放入干凈PCR管中，條帶濃時少量，淡時多量。先用雙蒸水清洗條帶，之后用移液槍把多余的水分吸取干凈。按選擇擴增時的反應體系和條件進行二次擴增。將擴增產物回收純化并連接至pEASY-T1克隆載體（全式金公司），挑選陽性克隆送公司測序。將克隆得到的序列在NCBI數據庫 （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的BLAST工具中進行同源性比對，利用Blast2Go軟件結合Amigo網站（http：//amigo1.geneontology.org/cgi-bin/amigo/blast.cgi）進行基因本體（Gene Ontology， GO）功能注釋和分類。

1.2.5 RACE方法克隆差異片段的3′端 根據已有的序列設計引物克隆差異片段的3′端，引物見表2。3′RACE-cDNA的合成參考Smart RACE（Clontech）操作說明。將擴增產物回收純化并連接至pEASY-T1克隆載體（全式金公司），然后挑選陽性克隆送公司測序。

1.2.6 差異片段的Real-time qPCR分析 根據差異片段的3′端序列設計Real-time qPCR引物，引物見表2。cDNA的合成參考RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）說明書，合成的第一鏈cDNA稀釋20倍后用于Real-time qPCR分析。運用ABI公司的7500 Fast熒光定量PCR儀，反應體系和程序參考SYBR Premix Ex TaqTM（Takara 公司）操作說明。以桂花的β-actin基因作為內參，葉片中基因轉錄水平設為1，采用2-ΔΔCt法來確定基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 桂花多樣本cDNA-AFLP體系的建立

對提取的花瓣和葉片RNA進行質量和濃度檢測，結果顯示，取200 mg材料提取RNA，所得RNA濃度更高、純度較高、完整性較好、電泳檢測質量較好（圖2：A）。分離出的花瓣和葉片中的mRNA集中分布在800～2 000 bp之間，呈彌散狀，mRNA的質量較好。利用分離的mRNA進一步合成的雙鏈cDNA呈彌散狀，主帶集中在500～1 000 bp（圖2：B）。以合成的雙鏈cDNA為模板擴增β-actin基因，得到與預期大小一致、條帶清晰的目的條帶（圖2：C），表明合成的雙鏈cDNA質量較高，符合進一步cDNA-AFLP分析要求。

用兩組限制性內切酶組合Ase I/Taq I和EcoR I/Mse I對花瓣和幼葉的雙鏈cDNA分別進行雙酶切。經Ase I/Taq I雙酶切的cDNA存在明顯的條帶集中區(qū)，主要在300 bp左右（圖3：A）;而經EcoR I/Mse I雙酶切后無明顯的條帶集中區(qū)， 在100～1 000 bp彌散分布（圖3：B）。對兩組酶切產物加接頭之后，取接頭連接產物分別進行25個和30個循環(huán)的預擴增反應，電泳結果表明，經Ase I/Taq I雙酶切的預擴增產物主要集中在100～250 bp，5個循環(huán)數的差異導致產物濃度差異較大（圖3：A）;而經EcoR I/Mse I雙酶切的預擴增產物在100～1 000 bp之間均勻分布，5個循環(huán)數的差異對產物濃度的影響并不太大（圖3：B）。

利用EcoR I/Mse I雙酶切的預擴增產物，進行256對選擇性擴增引物組合的初步分析（表3）。從表3可以看出，其中96對引物擴增出的條帶數目多且清晰可辨度高，定為A級;121對引物擴增出的條帶數目和清晰度適中，列為B級;另有39對引物擴增產物條帶數目少或模糊， 列為C級。

2.2 差異表達TDFs的獲得及功能分析

在花發(fā)育過程cDNA-AFLP分析中，以葉片為對照（泳道7），部分引物選擇擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖4：A。將TDFs的差異表達模式大致分為三大類：第一類為花瓣與幼葉中持續(xù)表達的基因（圖4：B）;第二類為幼葉中不表達，但不同發(fā)育時期的花瓣中無明顯差異的基因（圖4：D）;第三類為花瓣中特異表達且在不同發(fā)育時期存在差異的基因（圖4：C，E）。選取第三類的TDFs進行切膠回收測序，共得到283條差異TDFs，根據選擇性擴增引物進行命名編號。

對獲得的283條序列利用Blast2GO和Amigo網站，結合NCBI數據庫BLAST結果進行GO功能注釋，結果如圖5。從圖5可以看出，120條序列沒有同源基因，占總序列的42%;有13條序列具有相應的同源基因，但這些同源基因無功能注釋，占總序列的5%;只有150條序列有相應的同源基因，也有詳細的功能注釋。根據相應同源基因在生物進程中的功能注釋，其生物學功能大致分為10類：初級代謝（41條，14%）、響應刺激（20條，7%）、運輸（19條，7%）、次級代謝（17條;6%）、細胞組成與發(fā)生（15條，5%）、發(fā)育過程（11條，4%）、氧化還原過程（10條;4%）、調控生物過程（8條，3%）、信號傳導（5條，2%）、其余功能（4條，1%）（參與細胞分裂或調控生物質量）。

2.3 部分差異表達TDFs的表達模式分析

選取已知功能的6個差異表達TDFS： M13E23-11、M13E32-24、M21E14-1、M22E31-11、M34E22-31和M41E14-13，進行Real-time qPCR檢測，如圖6所示。Real-time qPCR檢測結果表明，其中M13E32-24、M21E14-1、M22E31-11和M34E22-31的表達模式符合cDNA-AFLP的表達譜特征。M13E32-24（圖6：B）在幼葉和鈴梗期花瓣中表達量很低，在花朵開放后表達量迅速增加，在第4天的盛花期表達量達到最高;M21E14-1（圖6：C）在第2天的初花期上午和第4天的盛花期表達量較高;M22E31-11（圖6：D）在花朵開放后表達有所增加，在第2天的初花期上午和第4、6天的盛花期表達量均較高;M34E22-31（圖6：E）僅在花瓣中表達，花朵開放后的表達量顯著增加，且整個花期維持較好水平。M13E23-11（圖6：A）除在第8天的盛花末期與cDNA-AFLP的表達存在差異，其他時期均保持一致。M41E14-13（圖6：F）與cDNA-AFLP的表達特征存在很大的差異，尤其是在盛花末期和葉片中的表達。由cDNA-AFLP圖可知，M13E23-11和M41E14-13的表達豐度很低。

3 討論

限制性內切酶的選擇和基因表達的豐度是影響cDNA-AFLP分析結果的關鍵。對不同的物種進行cDNA-AFLP分析時，所適用的限制性內切酶也不盡相同（韓斌和彭建營，2006）。在菜心、黃瓜和油菜等農作物中常選用TaqⅠ/AseⅠ組合（肖旭峰等，2013;孫涌棟等，2008;王家豐，2009），而在菊花、芍藥和珠眉海棠等觀賞植物中更趨向選用EcoRⅠ/MseⅠ組合（任洪艷等，2011;孫曉梅等，2015;李志紅等，2008）。本研究比較了這兩種組合在桂花中的酶切效果，結果發(fā)現，經TaqⅠ/AseⅠ組合酶切后的cDNA及預擴增產物多集中在300 bp左右，而且分布不均勻;經EcoRⅠ/MseⅠ組合酶切后的cDNA及預擴增產物在100～1 000 bp均勻分布，由此說明EcoRⅠ/MseⅠ組合更適合用于桂花cDNA酶切。后續(xù)選取的6個已知功能TDFs進行表達模式驗證，4個表達豐度較高的TDFs的qRT-PCR與AFLP結果一致，證明cDNA-AFLP技術能夠較為準確地檢測出差異表達基因，具有良好的可行性和可靠性。與張園（2009）和Han et al.（2015）僅對兩個樣本進行cDNA-AFLP分析相比，本研究可以呈現基因表達水平的動態(tài)變化過程，多態(tài)性更為豐富，可提高低豐度基因篩選的準確性。

桂花花香和花色物質成分和含量隨著開花或衰老進程而變化（Zeng et al.， 2015;鄒晶晶等，2017）。本研究利用cDNA-AFLP分析了桂花葉片和不同發(fā)育時期花瓣中基因的表達差異，共獲得283個在花瓣中特異表達且在花發(fā)育各時期差異表達的TDFs。對其中150個有相應功能注釋的TDFs進行分類，涉及次級代謝、初級代謝、發(fā)育過程、響應刺激、調控、運輸等多個生物學過程。次級代謝過程直接參與花香或花色物質的合成（Dudareva et al.， 2013;Tanaka et al.， 2008）。本研究共獲得17條參與次生代謝過程的TDFs，包含萜類香氣物質、類胡蘿卜素和類黃酮色素成分代謝等的多個基因。但是，獲得的參與次生代謝過程的TDFs只占6%。為次級代謝過程提供前體物質的初級代謝過程占比最大，達14%。其余的80%涉及發(fā)育過程、響應次級、調控等多個生物學過程。由此說明，花香與花色的形成受多個生物學過程的影響;初級代謝過程作為中間代謝物的提供者，對桂花色香代謝的影響值得深入研究。本研究結果為挖掘開花進程中色香形成的相關基因，揭示其分子調控機制提供了重要參考，為進一步從分子水平研究桂花的花香與花色形成奠定了基礎。

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