雷公藤甲素微乳凝膠對CIA大鼠T細(xì)胞相關(guān)因子調(diào)節(jié)作用研究

管詠梅 張建林 劉佳

摘要 目的：觀察雷公藤甲素微乳凝膠（TP-MBGs）外用對CIA大鼠T細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平的影響，以探究其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：將56只CIA模型大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、基質(zhì)組、TP灌胃組、TP微乳高劑量組、TP-MBGs高、中、低劑量組，給藥28 d后處理，采用ELISA法檢測各組大鼠皮膚（CD1α、IgA）、血清（IFN-γ、IL-6、TNF-α、ColⅡ、IL-10）及滑膜細(xì)胞上清液（IL-1、PGE2、TNF-α）中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組皮膚中CD1α、血清中IFN-γ、IL-6、TNF-α和滑膜細(xì)胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-α的表達(dá)水平明顯升高;與模型組比較，TP-MBGs中劑量組血清中的TNF-α及IL-6、滑膜細(xì)胞上清液中的IL-1及TNF-α表達(dá)水平顯著降低;TP-MBGs高劑量組皮膚中CD1α、血清中的TNF-α及IFN-γ、滑膜細(xì)胞上清液中的IL-1及TNF-α的表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論：雷公藤甲素微乳凝膠外用治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，可能通過調(diào)節(jié)皮膚免疫功能及抑制相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，從而起到局部及全身治療作用。

關(guān)鍵詞 TP-MBGs;CIA模型;RA;T細(xì)胞相關(guān)因子;調(diào)節(jié)作用;ELISA法;經(jīng)皮給藥;機(jī)制

Abstract Objective：To observe the effects of triptolide microemulsion gel（TP-MBGs）on the expression of T cell related factors in CIA rats，and to explore the mechanism of its treatment of rheumatoid arthritis.Methods：A total of 56 CIA rats were randomly divided into a blank group，a model group，a matrix group，a TP intragastric administration group，a TP microemulsion high dose group，a TP-MBGs high，middle and low dose group.After 28 days of administration，the expression level of the rat skin of CD1α，IgA，the serum of IFN-γ，IL-6，TNF-α，ColⅡ，IL-10 and the synovial cell supernatant of IL-1，PGE2，TNF-α were detected by ELISA.Results：Compared with the blank control group，the expression of CD1α in skin，IFN-γ，IL-6，TNF-α in serum and IL-1，PGE2，TNF-α in synovial cell supernatant were significantly increased in the model group.Compared with the model group，the expression levels of TNF-α and IL-6 in serum，IL-1 and TNF-α in the supernatant of synovial cells in the middle dose TP-MBGs group were significantly decreased than those in the model group.The expression of CD1α in skin，TNF-α and IFN-γ in serum，IL-1 and TNF-α in synovial cell supernatant decreased significantly in high dose TP-MBGs group.Conclusion：Tripterygium wilfordii microemulsion gel for external treatment of rheumatoid arthritis may play a local and systemic role by regulating skin immune function and inhibiting the secretion of related cytokines.

Key Words TP-MBGs; CIA model; RA; T cell related factors; Regulation effects; ELISA; Transdermal administration; Mechanism

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.002

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rhumatoid Athritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)和骨損傷為主要特征的全身性自身免疫疾病，其患病率較高[1-2]。全世界不同地區(qū)人群中RA的發(fā)病率為0.18% ～1.07%，其中北歐及北美地區(qū)RA的發(fā)病率竟達(dá)到0.5% ～1.1%[3]，如果不及時進(jìn)行治療，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞、畸形和功能障礙等，致殘率極高，難以治愈，素來有“不死癌癥”之稱。中藥雷公藤治療RA歷史悠久，療效佳，其主要的活性成分之一是環(huán)氧化二萜內(nèi)酯類化合物雷公藤甲素（Triptolide，TP），藥理學(xué)研究表明TP具有顯著的抗炎和免疫抑制作用，也是目前雷公藤制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。為了改善目前臨床上使用雷公藤口服制劑，產(chǎn)生的嚴(yán)重的肝、腎、生殖等毒性，課題組前期通過將TP制備成外用制劑微乳凝膠進(jìn)行研究，TP單體的研究可以改善雷公藤中成分復(fù)雜和TP含量差異大的問題。早期就有研究表明在給予雷公藤外用治療后，血藥濃度較口服血藥濃度低，而治療效果卻與口服制劑相當(dāng)，且不良反應(yīng)較小[4]。雷公藤甲素微乳凝膠（Triptolide Microemulsion Based Gels，TP-MBGs）外用可以直接作用在病灶部位，增加藥物的滲透性，且前期藥效學(xué)實(shí)驗表明TP-MBGs對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（Collagen Induced Arthritis，CIA）模型大鼠具有較好的治療效果。但對TP-MBGs治療RA的作用機(jī)制的研究較少，故本實(shí)驗通過建立CIA大鼠模型，從皮膚免疫及抗炎方面，研究TP-MBGs外用治療RA的作用機(jī)制，以期為指導(dǎo)TP-MBGs臨床使用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2011-0003，實(shí)驗動物從業(yè)人員上崗證號：贛3936）。

1.1.2 藥物 TP（批號：160513，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 試劑與儀器 弗氏完全佐劑7001（北京博蕾德生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：160308）;牛II型膠原蛋白20022（北京博蕾德生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：160177）;酶標(biāo)儀（Multlskan Mk3賽默飛世爾儀器有限公司）;計算機(jī)（TFT185W80PS冠捷顯示科技有限公司）;大鼠TNF-α試劑盒（KIT，XL-Er0201 Abcam公司）;轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（徠卡-2016，德國）;TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司）;BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)（常州郊區(qū)中威電子儀器廠）;PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）;數(shù)碼三目攝像顯微鏡（BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）等;圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取8只作為空白對照組，其余進(jìn)行造模。將牛Ⅱ型膠原蛋白與弗氏完全佐劑在冰浴條件1∶ 1乳化，形成穩(wěn)定的乳化劑（水中成團(tuán)）。在大鼠尾根部2 cm處注射乳化劑0.2 mL/只，7 d后在離大鼠尾根部1.5 cm處注射乳化劑0.1 mL/只再次免疫1次。

從初次免疫第1天起，每日觀察四肢腫脹情況，按照0～4級評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[5]，0分：無關(guān)節(jié)炎;1分：小趾關(guān)節(jié)輕度腫脹;2分：小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部關(guān)節(jié)腫脹。四肢評分之和為關(guān)節(jié)炎指數(shù)（Arthritis Index，AI），AI越高，表明關(guān)節(jié)炎程度越嚴(yán)重。初次免疫后第14天進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，AI≥4即為造模成功，將AI評分不足大鼠剔除，最終隨機(jī)選取56只CIA模型大鼠進(jìn)行實(shí)驗。將56只CIA模型大鼠，按評分梯度均勻分為模型組、基質(zhì)組、TP灌胃組、TP微乳高劑量組、TP-MBGs高、中、低劑量組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 空白對照組和模型組正常飼養(yǎng)，TP灌胃組灌胃給藥，其余各組均涂在患病關(guān)節(jié)部位，給藥量見表1，1次/d，連續(xù)給藥28 d，為方便給藥各組大鼠給藥部位定期進(jìn)行剃毛處理。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 大鼠皮膚組織CD1α、IgA平均吸光度的測定 取大鼠皮膚，4%多聚甲醛固定后均按病理檢驗SOP程序進(jìn)行。脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后鏡檢。采用BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)顯微攝像系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再根據(jù)組織大小及表達(dá)情況分別選取1個區(qū)域400倍采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的吸光度（absorbance A），并計算其平均值。

1.2.3.2 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清中IFN-γ、IL-6、TNF-α、ColⅡ、IL-10的水平 各組大鼠采用10%水合氯醛腹腔麻醉，于腹主動脈取血，室溫放置1 h，取上清液2 000 r/min離心10 min得血清。采用ELISA法檢測血清中ColⅡ、IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α的含量，其操作過程按照試劑盒提供的方法進(jìn)行。

1.2.3.3 采用ELISA法測定大鼠滑膜細(xì)胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-α水平 在無菌條件下，取各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用D-hank′s液洗滌3次以去除血細(xì)胞，仔細(xì)剔除脂肪組織后，獲得較純的白色滑膜組織塊。剪成約1～2 mm2大小，Ⅱ型膠原酶消化3 h后，離心收集未貼壁的細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化5 min，離心棄去上清液，將細(xì)胞重懸于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，離心收集上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明測定滑膜細(xì)胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-α的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP對大鼠皮膚組織CD1α、IgA平均吸光度的影響 模型組與空白對照組比較，CD1α表達(dá)水平明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其余各給藥組與模型組比較，CD1α均有降低趨勢，其中TP灌胃組和TP-MBGs高劑量組降低程度明顯（P<0.05），基質(zhì)組與模型組幾乎相等，而IgA的表達(dá)在各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.2 TP對大鼠血清中IFN-γ、IL-6、TNF-α、ColⅡ、IL-10水平的影響 模型組與空白組比較，大鼠血清中IFN-γ、IL-6、TNF-α水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而ColⅡ與IL-10無統(tǒng)計學(xué)意義;基質(zhì)組與模型組比較，各因子水平幾乎相等;其余各組與模型組比較，TP灌胃組、TP微乳高劑量組及TP-MBGs高劑量組中IFN-γ濃度顯著性降低（P<0.05），TP-MBGs中、高劑量組及TP灌胃組的TNF-α水平顯著降低（P<0.05），TP灌胃組及TP-MBGs中劑量組的IL-6的水平顯著降低（P<0.05）;ColⅡ和IL-10的水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

2.3 TP對大鼠滑膜細(xì)胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-α的影響 模型組與空白組大鼠比，滑膜細(xì)胞上清液中IL-1、PGE2及TNF-α的含量均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;基質(zhì)組與模型組比較，IL-1、PGE2、TNF-α水平幾乎相等，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而與模型組比較，TP灌胃組、TP-MBGs高、中劑量組及TP微乳高劑量組中IL-1、PGE2及TNF-α的含量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

CIA模型在臨床表現(xiàn)、病理組織學(xué)及體液免疫反應(yīng)方面與RA有諸多相似之處，是目前復(fù)制RA最佳的動物模型[6-7]，故本實(shí)驗選擇CIA為RA的動物模型進(jìn)行研究。樹突狀細(xì)胞（DC）是目前所知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，它的數(shù)量和活性將會直接影響免疫應(yīng)答過程，從而直接參與RA的發(fā)展過程。CD1α是樹突狀細(xì)胞的特征性抗原，在皮膚中大量表達(dá)并發(fā)揮免疫作用[8]。本實(shí)驗結(jié)果表明，模型組與空白比較，CD1α的表達(dá)水平顯著升高，而TP灌胃組，TP-MBGs高劑量組與模型組比較，CD1α的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），說明在制備大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型后，免疫功能出現(xiàn)異常，樹突狀細(xì)胞表達(dá)水平升高，RA的發(fā)展與樹突狀細(xì)胞的表達(dá)密切相關(guān)，而TP-MBGs外用可通過下調(diào)皮膚中CD1α的表達(dá)水平從而起到治療RA的作用。

RA是自身免疫性疾病，因此對血液和關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中的細(xì)胞因子進(jìn)行研究，其中IL-6是一種重要的多效性細(xì)胞因子，由體內(nèi)多種細(xì)胞分泌，是RA的關(guān)鍵細(xì)胞因子。它對RA的主要致病作用包括促進(jìn)炎性反應(yīng)相關(guān)的B細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化以及急性期蛋白的合成;誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，造成關(guān)節(jié)損傷;與IL-1共同誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生，破壞關(guān)節(jié)軟骨等[9]。在RA患者血清及受累關(guān)節(jié)的滑液中均可觀察到IL-6濃度升高，并且濃度升高與患者臨床表現(xiàn)的輕重相關(guān)[10]。TNF-α是一種多效性的細(xì)胞因子，是RA發(fā)病過程中主要的促炎因子，被認(rèn)為是與RA滑膜炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系最密切的促炎遞質(zhì)，在RA的局部滑膜炎性反應(yīng)、血管翳的生成和組織損傷中都發(fā)揮了重要作用，可作為疾病活動度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗中，空白組與模型組比較，大鼠血清中IL-6、TNF-α及IFN-γ的水平顯著升高，表明RA的發(fā)病過程與炎性反應(yīng)因子的水平密切相關(guān)。TP灌胃組與TP-MBGs中劑量組相較于模型組，IL-6水平顯著降低;TP灌胃組、微乳高劑量組及TP-MBGs高劑量組的IFN-γ濃度較模型組顯著降低;與模型組比較，TP灌胃組及TP-MBGs中劑量組的TNF-α的表達(dá)水平顯著降低。表明TP-MBGs外用可通過降低血清中相關(guān)炎性反應(yīng)因子，發(fā)揮全身作用，從而達(dá)到治療RA的效果。

在機(jī)體處于炎性反應(yīng)情況下，IL-1被大量表達(dá)，它的2種亞型IL-1α和IL-1β在介導(dǎo)炎性反應(yīng)和免疫過程中發(fā)揮重要作用。適量的IL-1可以增強(qiáng)機(jī)體抵御外界入侵的能力，而過多IL-1則引起關(guān)節(jié)損害，表現(xiàn)出類似RA的癥狀。在RA發(fā)病中IL-1可以刺激成纖維細(xì)胞增殖和血管翳生成，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多PGE2，引起白細(xì)胞向滑膜部位聚集以及金屬基質(zhì)蛋白酶、膠原酶的分泌，加劇關(guān)節(jié)破壞[11]。本實(shí)驗中，較空白組，模型組大鼠滑膜細(xì)胞上清液中的IL-1、PGE2及TNF-α的水平明顯升高;較模型組，TP灌胃組、微乳高劑量組、TP-MBGs中、高劑量組的IL-1及TNF-α水平顯著降低;TP灌胃組、TP-MBGs中劑量組及TP-MBGs高劑量組中PGE2濃度明顯降低?；|(zhì)組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明基質(zhì)對RA不產(chǎn)生影響，表明TP-MBGs可降低局部滑膜細(xì)胞中的致炎因子，且TP-MBGs與灌胃組效果相當(dāng)，這可能是其外用治療RA的作用機(jī)制之一。

綜上所述，TP-MBGs外用治療RA，可能通過調(diào)節(jié)皮膚免疫功能及抑制相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，從而起到局部及全身治療作用。TP-MBGs外用與TP口服相比效果相當(dāng)，均有一定的治療效果。其中微乳凝膠基質(zhì)對RA無明顯的治療效果TP-MBGs較TP微乳指標(biāo)更趨向于空白對照組，治療效果更好。

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（2019-06-05收稿 責(zé)任編輯：徐穎）