復(fù)方止血消炎軟膏中五倍子鞣質(zhì)的提取工藝研究

管詠梅 宋昕祁 張建林

摘要 目的：對(duì)五倍子鞣質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為復(fù)方止血消炎軟膏的制備工藝提供一定參考依據(jù)。方法：建立沒(méi)食子酸的高效液相色譜分析方法，其色譜條件為：流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸（4∶ 11∶ 85）;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm;流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。然后，以沒(méi)食子酸提取率為指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)之上，固定提取次數(shù)，以水的用量，提取時(shí)間，提取溫度為因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化總鞣質(zhì)的提取工藝。結(jié)果：建立的高效液相色譜分析方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均符合藥典要求，沒(méi)食子酸在2.34～300 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：Y=29.955X+9.635 2，r=1，其平均加樣回收率為101.88%。正交試驗(yàn)優(yōu)選的鞣質(zhì)最佳提取工藝為A3B1C3，即在80 ℃水浴中，用12倍量的水作為溶劑，提取2次，1.5 h/次。結(jié)論：本文所建立的高效液相色譜法色譜分析方法準(zhǔn)確，穩(wěn)定，可用于沒(méi)食子酸的含量測(cè)定;正交試驗(yàn)優(yōu)選的五倍子提取工藝穩(wěn)定可靠，適用于總鞣質(zhì)的提取。

關(guān)鍵詞 五倍子;鞣質(zhì);沒(méi)食子酸;浸漬法;正交試驗(yàn);工藝優(yōu)化;HPLC;應(yīng)用

Abstract Objective：To optimize the extraction process of Galla Chinensis tannin，and to provide a reference for the preparation of compound Zhixue Xiaoyan ointment.Methods：HPLC method for the analysis of gallic acid was established.The chromatographic conditions were as follows：mobile phase：methanol：acetonitrile：0.2% phosphate 4∶ 11∶ 85; column temperature：30 ℃; detection wavelength：273 nm; flow rate：1 mL/min，injection amount：10 μL.Then，the extraction rate of gallic acid was taken as the index，the extraction times were fixed on the basis of single factor investigation，and the orthogonal experiment was carried out to optimize the extraction process of total tannin by orthogonal test with water dosage，extraction time and extraction temperature as factors.The L9（34）orthogonal table was used to carry out the orthogonal test to optimize the extraction process of total tannin.Results：The precision，repeatability and stability of the HPLC method were all in line with the requirements of pharmacopoeia.The linear relationship between the concentration of gallic acid in the range of 2.34～300 μg and the peak area was good.The regression equation was Y=29.955X+9.6352，the correlation coefficient r=1，and the average recovery rate was 101.88%.The optimum extraction process of tannin by orthogonal test was A3B1C3，that is，in 80 ℃ water bath，12 times of water was used as solvent to extract tannin twice for 1.5 hours each time.Conclusion：The HPLC method established in this paper is accurate and stable，and can be used for the determination of gallic acid，and the optimum extraction process of Galla Chinensis by orthogonal test is stable and reliable，which is suitable for the extraction of total tannins.

Key Words Galla Chinensis; Tannin; Gallic acid; Soaking extraction; Orthogonal test; Process optimization; HPLC; Application

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.005

肛瘺是臨床上常見(jiàn)的肛腸科疾病，手術(shù)是目前肛瘺的主要治療方法，術(shù)后開(kāi)放性創(chuàng)面是不可避免的，其愈合過(guò)程為二期愈合，在創(chuàng)口愈合過(guò)程中，肉芽組織的生成、成長(zhǎng)速度及其質(zhì)量是愈合過(guò)程的關(guān)鍵之一，如何加速肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合，是肛腸科醫(yī)師亟待解決的問(wèn)題，中醫(yī)藥治療在肛瘺術(shù)后的治療有獨(dú)特的理論基礎(chǔ)和臨床特色，其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的方法很多，既有內(nèi)治法，又有外治法。外治法由于操作簡(jiǎn)便，療效確切等優(yōu)勢(shì)在臨床上應(yīng)用廣泛[1]。復(fù)方止血消炎軟膏是臨床經(jīng)驗(yàn)方，在肛瘺術(shù)后治療中有良好的治療效果，五倍子是其中的君藥。

五倍子為漆樹(shù)科植物鹽膚木Rhus chinensis Mill、青麩楊Rhus potaninii Maxim或紅麩楊Rhus punjabensis Stew.var.sinica（Diels）Rehd.et Wils.葉上的蟲(chóng)癭，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis（Bell）Baker寄生而形成[2]。其始載于《開(kāi)寶本草》，具有斂肺降火、斂汗、止血等作用。我們國(guó)家生產(chǎn)的五倍子質(zhì)量較好，主要集中在云南、貴州、陜西、四川等地產(chǎn)出，占世界總量的95%左右[3]。鞣質(zhì)為五倍子的主要有效成分，具有抗菌、抗病毒，抗氧化、清除自由基等藥理作用，在臨床上主要用于治療腹瀉、潰瘍及降低蛋白尿等[4]。除此之外，五倍子鞣質(zhì)還能明顯縮短出血時(shí)間，是一種有效的凝血物質(zhì)，在臨床上可用于分離血漿。沒(méi)食子酸是目前發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的天然多酚類(lèi)化合物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等多種作用，對(duì)肝纖維化、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病和腫瘤等具有防治作用[5]。

由于五倍子鞣質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，在提取過(guò)程中，易發(fā)生氧化、離解或聚合等化學(xué)反應(yīng)，給含量測(cè)定帶來(lái)了一定困難。在酸性條件下，水解總鞣質(zhì)可得到化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定的沒(méi)食子酸，兩者在量上成正比例關(guān)系，通過(guò)測(cè)定沒(méi)食子酸含量，可反映出總鞣質(zhì)的含量。關(guān)于五倍子總鞣質(zhì)的提取研究較多，主要包括浸漬法、超聲提取、微波提取、加壓提取和超臨界流體萃取法等。而五倍子屬院內(nèi)制劑復(fù)方止血消炎軟膏中的君藥，考慮到在實(shí)際生產(chǎn)中的可行性，本文選擇溫水浸漬法提取五倍子鞣質(zhì)，在此基礎(chǔ)之上優(yōu)化五倍子的提取工藝，為后期院內(nèi)制劑申報(bào)提供一定參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，二極管陣列檢測(cè)系統(tǒng)）;KQ5200B型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）;KN-500型粉碎機(jī)（濟(jì)南易辰超微粉碎技術(shù)有限公司）;電子天平BS124S（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;10TH實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器型（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）;BCD-215KJN型冷藏冷凍冰箱（青島海爾股份有限公司）;1 000 μL移液器（Thermo公司）;萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）;渦旋儀（IKA儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑 沒(méi)食子酸對(duì)照品（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程中心，生產(chǎn)批號(hào)：BCTG-0169，純度>98%）;甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司）;乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司）;甲醇（分析純，西隴化工股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：170106）;乙醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司;批號(hào)：180102）。

1.3 分析樣品 五倍子（江西江中中藥飲片有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：170214）。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸（4∶ 11∶ 85）;溫度：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm;流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)算不低于6 000。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備 取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精密稱定約6 g，置于10 mL容量瓶中，加50%（V/V）甲醇溶液稀釋至刻度線，置于微型振蕩器震蕩2 min，充分混勻，制成600 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備 取五倍子藥材適量，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，再取1 g，精密稱定，加入10倍量體積的蒸餾水，50 ℃水浴中加熱浸漬2 h，提取2次，過(guò)濾，合并濾液，并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干。再加入4 mol/L鹽酸溶液20 mL，60 ℃水浴中加熱水解3.5 h，放冷，定容至25 mL，取1 mL于10 mL容量瓶中，加50%（V/V）甲醇溶液定容。用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液適量，即為供試品溶液。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取空白溶劑、沒(méi)食子酸對(duì)照品和五倍子供試品按“2.1”項(xiàng)下建立的色譜條件進(jìn)樣。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別用50%（V/V）甲醇配制成含沒(méi)食子酸300，150，75，37.5，18.75，9.375，2.34 μg/mL的對(duì)照品溶液。按上述色譜條件對(duì)各濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，以對(duì)照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣10 μL/次，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄色譜峰的峰面積及相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算RSD值。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)的方法制備五倍子供試品溶液一份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積值，計(jì)算RSD值。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份五倍子供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰的峰面積及相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算RSD值。

2.9 回收率試驗(yàn) 首先，制備五倍子供試品溶液一份，按照上述色譜條件測(cè)定3次，取平均值為實(shí)際含量。精密量取已知含量的試品溶液2 mL，共9份，每3份為一組，按實(shí)際含量的0.5，1，1.5倍加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，分別作為高、中、低水平，以“2.1”項(xiàng)色譜條件分別對(duì)各樣品其進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算沒(méi)食子酸的加樣回收率。

3 結(jié)果

3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明空白溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

3.2 線性關(guān)系結(jié)果 求得回歸方程：Y=29.955X+9.635 2，r=1。結(jié)果表明：在2.34～300 μg范圍內(nèi)，沒(méi)食子酸的濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖2。

3.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 3 d內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.07%，0.13%及0.18%，表明該儀器的日內(nèi)及日間精密度良好。見(jiàn)表1。

3.4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 24 h內(nèi)供試品色譜峰峰面積值的RSD值為0.35%，表明沒(méi)食子酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表2。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 6份樣品峰面積的RSD值為1.53%，表明該方法重復(fù)性良好。見(jiàn)表3。

3.6 回收率試驗(yàn)結(jié)果 高、中、低水平的回收率值均小于103%，其平均回收率為101.88%，RSD值為0.56%，符合藥典要求。表明該方法準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表4。

3.7 正交試驗(yàn)優(yōu)選五倍子鞣制的提取工藝

3.7.1 正交試驗(yàn)的因素及水平選擇 在查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]后，采用水作為提取溶劑，對(duì)提取次數(shù)，料液比，提取時(shí)間，提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素考察。以沒(méi)食子酸含量為指標(biāo)，先固定3個(gè)因素的水平，對(duì)另外一個(gè)因素設(shè)定5個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察該因素對(duì)沒(méi)食子酸提取量的影響。首先考察了提取次數(shù)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，五倍子中沒(méi)食子酸已基本提取完全，所以固定提取次數(shù)為2次。然后，選擇溶劑用量分別為4，6，8，10，12倍量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：料液比小于1∶ 10時(shí)，沒(méi)食子酸的提取率隨著溶劑用量的增加而增大，此后，隨著料液比的增加，提取率有所降低。最終正交試驗(yàn)的溶劑用量的水平分別為8，10，12倍量。此后，選擇提取溫度分別為40，60，80，100 ℃進(jìn)行回流提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：溫度為60 ℃時(shí)，沒(méi)食子酸的提取率最高，此后隨著溫度升高，沒(méi)食子酸含量逐漸下降，最終選擇提取溫度為40，60，80 ℃ 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。最后，分別選取提取時(shí)間為1，1.5，2，2.5，3 h進(jìn)行回流提取實(shí)驗(yàn)，當(dāng)提取時(shí)間由1 h增加到2 h時(shí)，提取率上升，此后延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率有所下降。最終選擇1.5，2，2.5 h作為3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.7.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素考察的基礎(chǔ)上，以沒(méi)食子酸的提取率為指標(biāo)，固定提取次數(shù)為2次，以溶劑用量、提取時(shí)間、提取溫度為3因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化五倍子的提取工藝。見(jiàn)表5、6。

由上表看出，因素A（料液比）的極差值最大，為45.307，因素B（提取時(shí)間）與因素C（提取溫度）的極差值基本相同，分別為19.680和19.853。表明，料液比對(duì)沒(méi)食子酸提取率的影響最大，是主要因素，提取溫度的影響次之，提取時(shí)間對(duì)該工藝的影響最小。從正交試驗(yàn)結(jié)果分析得到，在9組試驗(yàn)中，沒(méi)食子酸的最高含量為117.33 mg/g，其工藝為A3B1C3，即在80 ℃水浴中，用12倍量的水作為溶劑，提取2次，1.5 h/次。為驗(yàn)證該提取工藝的可靠性，采用相同提取工藝條件，平行制備3份樣品，結(jié)果表明，該工藝條件穩(wěn)定，可靠，可用于五倍子鞣質(zhì)的提取。

4 討論

在沒(méi)食子酸HPLC分析方法的建立過(guò)程中，首先對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在273 nm處，沒(méi)食子酸響應(yīng)值較大，其他雜質(zhì)成分基本無(wú)干擾，因此選擇該波長(zhǎng)為最終檢測(cè)波長(zhǎng)。在流動(dòng)相的選擇過(guò)程中，采用甲醇與磷酸混合使用，其色譜峰峰形拖尾嚴(yán)重，增加磷酸的體積濃度也無(wú)改善，采用乙腈與磷酸混合使用，其峰形前沿嚴(yán)重，不加磷酸，則洗脫不出沒(méi)食子酸。所以選擇甲醇-乙腈-磷酸3種試劑為最終流動(dòng)相，其峰形良好，對(duì)稱因子符合要求，樣品中沒(méi)食子酸色譜峰與其他色譜峰之間的分離度均大于1.5。在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)階段，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，五倍子中沒(méi)食子酸已基本提取完全，所以固定提取次數(shù)為2次，未將提取次數(shù)作為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，減少工作量。

五倍子總鞣質(zhì)屬于可水解鞣質(zhì)，是復(fù)雜多元酚類(lèi)的混合物，相對(duì)分子質(zhì)量較大、極性強(qiáng)、易溶于水。但其含量測(cè)定較困難，常以沒(méi)食子酸的量表征五倍子總鞣質(zhì)的含量。沒(méi)食子酸又稱五倍子酸，化學(xué)名稱為3，4，5-三羥基苯甲酸，是五倍子鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物。通過(guò)五倍子制備沒(méi)食子酸的途徑有2種，包括化學(xué)法和生物法，化學(xué)法分為酸水解法和堿水解法，生物法包括酶法和發(fā)酵法，在完全水解的情況下，五倍子鞣質(zhì)可生成7～9分子的沒(méi)食子酸[8]。

目前，工業(yè)上直接以水為溶劑從五倍子中浸提鞣質(zhì)，所得產(chǎn)品最高純度為78% ～80%，僅僅適用于工業(yè)上的使用要求，而對(duì)醫(yī)藥行業(yè)所需要的高純度、高質(zhì)量的鞣質(zhì)，則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足。一方面，由于五倍子鞣質(zhì)是復(fù)雜多元酚類(lèi)的混合物，分子量較大、極性強(qiáng)，而且植物鞣質(zhì)與黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)和木質(zhì)素等在植物體內(nèi)共存并且性質(zhì)相近，因此分離提純?yōu)閱误w是非常困難的;另一方面，鞣質(zhì)性質(zhì)較為活潑，在提純過(guò)程中，容易發(fā)生氧化、離解、或聚合等化學(xué)反應(yīng)，從而也給鞣質(zhì)的定量測(cè)定帶來(lái)很大困難。有研究表明[9]，pH=2的環(huán)境下，以100%丙酮作為提取溶劑、溫度50 ℃、時(shí)間10 min為五倍子鞣質(zhì)的最佳提取工藝并采用乙酸乙酯萃取的鞣質(zhì)最終得率較高，且鞣質(zhì)純度達(dá)到了89.15%。但主要存在有機(jī)溶劑殘留的問(wèn)題，在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用還受到限制。在今后的研究中需要進(jìn)一步探索五倍子鞣質(zhì)的提取方法，以期得到一種簡(jiǎn)易可行、純度較高、質(zhì)量較好且適宜于制藥行業(yè)應(yīng)用的鞣質(zhì)提取方法。

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（2019-06-05收稿 責(zé)任編輯：徐穎）