高效液相色譜法檢測(cè)二仙湯中淫羊藿黃酮類成分的含量

高芳芳 劉耀龍 李慧

摘要 目的：通過高效液相色譜法（HPLC）對(duì)二仙湯中淫羊藿黃酮類成分進(jìn)行含量檢測(cè)，并采用4個(gè)不同產(chǎn)地的淫羊藿進(jìn)行多角度分析。方法：進(jìn)樣體積為1 μL;色譜柱的的溫度控制在40 ℃;流動(dòng)相A以0.1%色譜純甲酸和5 mmol/L的色譜純乙酸銨均勻混合而成;流動(dòng)相B以色譜純甲醇和超純水均勻混合而成，研究中進(jìn)行所有高效液相色譜線性梯度洗脫程序。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置在270 nm時(shí)可以檢測(cè)到較多的吸收峰。前期對(duì)HPLC進(jìn)行常規(guī)的可靠性方法學(xué)考察，包括專屬性、精密度、穩(wěn)定性等，然后進(jìn)一步對(duì)淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果：二仙湯中淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷對(duì)照品、淫羊藿次苷Ⅱ?qū)φ掌贰⒊蕉˙對(duì)照品和朝藿定C對(duì)照品均可見良好的分離度，且不存在任何內(nèi)源性的干擾物質(zhì)，每一個(gè)黃酮類成分專屬性均較好。淫羊藿苷線性回歸方程：Y=34.012X-12.99;淫羊藿次苷Ⅱ線性回歸方程：Y=39.875X-7.134;朝藿定B線性回歸方程：Y=23.997X-8.416;朝藿定C線性回歸方程：Y=29.896X-15.38。淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C精密度試驗(yàn)的RSD值分別為0.33%、0.64%、0.57%、0.52%;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD值分別為1.09%、1.62%、1.78%、0.41%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD值分別為2.61%、2.75%、2.48%、1.22%;二仙湯供試品溶液中淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的平均回收率分別為（96.87±2.15）%、（99.46±1.52）%、（101.64±2.43）%、（99.79±2.31）%。二仙湯供試品溶液中淫羊藿黃酮類成分的含量高于淫羊藿單味藥材供試品溶液;從淫羊藿不同產(chǎn)地中黃酮類成分含量的角度比較，發(fā)現(xiàn)四川產(chǎn)地的淫羊藿中測(cè)得的黃酮類成分高于其他3個(gè)產(chǎn)地，陜西產(chǎn)地淫羊藿次之，其后為湖北產(chǎn)地淫羊藿，而湖南產(chǎn)地淫羊藿黃酮類成分含量最低。結(jié)論：采用HPLC檢測(cè)二仙湯中淫羊藿黃酮類成分含量具有良好的可靠性，且二仙湯供試品溶液中淫羊藿黃酮類成分的含量高于淫羊藿單味藥材供試品溶液。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法;二仙湯;淫羊藿苷;淫羊藿次苷Ⅱ;朝藿定B;朝藿定C

Abstract Objective：To determine the content of epimedium flavonoids in Erxian Decoction by high performance liquid chromatography（HPLC），and to analyze Herba Epimedii from 4 different habitats.Methods：Sample volume was 1 μL; column temperature was controlled at 40 ℃; mobile phase A was homogeneously mixed with 0.1% pure formic acid and 5 mmol/L pure ammonium acetate; mobile phase B was homogeneously mixed with pure methanol and ultra-pure water.Linear gradient elution procedures of high performance liquid chromatography were studied.When the detection wavelength was set at 270 nm，more absorption peaks can be detected.In the early stage，the routine reliability methodologies of HPLC were investigated，including specificity，precision，stability，etc.Then the contents of icariin，icariin II，Icariin B，Icariin C were further determined and analyzed.Results：1）Icariin，Icariin II，Chaohoding B and Chaohoding C in Erxian Decoction showed good isolation，and there was no endogenous interfering substance.Each flavonoid had good specificity. 2）The results of linear regression analysis showed that the linear regression equation of icariin was Y=34.012X-12.99; the linear regression equation of icariin II was Y=39.875X-7.134; the linear regression equation of Chaohuoding B was Y=23.997X-8.416; and the linear regression equation of Chaohuoding C was Y=29.896X-15.38. 3）The RSD values of precision tests of icariin，icariin II，Chaixiding B，Chaixiding B，and Chaixiding C were 0.33%，0.64%，0.57%，0.52%.RSD values of stability test were 1.09%，1.62%，1.78%，0.41%.RSD values of repetitive test were 2.61%，2.75%，2.48%，1.22%. 4）The average recoveries of icariin，icariin II，Chaohoding B and Chaohoding C were（96.87±2.15）%，（99.46±1.52）%，（101.64±2.43）%，（99.79±2.31）%，respectively. 5）The content of epimedium flavonoids in Erxian Decoction was higher than that of sample solution of single herb of Herba Epimedii.From the point of view of the content of flavonoids in different habitats of Herba Epimedii，it was found that the content of flavonoids in Herba Epimedii from Sichuan was higher than that in the other 3 habitats，followed by Herba Epimedii from Shaanxi，Herba Epimedii from Hubei，and Herba Epimedii from Hunan.The content of flavonoids was the lowest.Conclusion：The determination of flavonoids in Erxian Decoction by HPLC has good reliability，and the content of flavonoids in Erxian Decoction is higher than that of single herb of Herba Epimedii.

Key Words High performance liquid chromatography; Erxian decoction; Icariin; Icariin II; Chaohuding B; Chaohuding C; Content analysis

中圖分類號(hào)：R289.4;R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.006

《中醫(yī)方劑臨床手冊(cè)》中收錄了二仙湯，而這一僅由淫羊藿、仙茅、當(dāng)歸、巴戟天、黃柏、知母組成的藥方，是以滋陰溫腎與益精降火并重的良方[1]，通過這2個(gè)功效對(duì)人體進(jìn)行雙重調(diào)節(jié)，不僅對(duì)婦女更年期綜合征[2]、性功能減退[3]等有療效，對(duì)骨質(zhì)疏松癥[4-5]，肩周炎[6-7]和老年性失眠[8-9]也有顯著的改善作用。二仙湯名字的由來，概其以淫羊藿和仙茅共為君藥，而淫羊藿又名仙靈脾，故而命名為二仙湯。仙茅的相關(guān)藥理研究較多，淫羊藿含有多種黃酮類成分，本研究以二仙湯復(fù)方水煎劑和淫羊藿單味藥水煎劑，采用高效液相色譜法（HPLC）比較2種不同形式析出的黃酮類成分進(jìn)行含量測(cè)定，比較二仙湯復(fù)方水煎劑和淫羊藿單味藥水煎劑中黃酮類成分的含量。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》淫羊藿中的黃酮類成分較多，本研究主要觀察其中最為重要的4中黃酮類成分，分別是淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C[10]?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 儀器型號(hào)為APS-6080A的高效液相色譜儀購自德國(guó)AUPOS科技有限公司（其中恒溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和熒光檢測(cè)器的儀器型號(hào)分別為：APS-5600、Spark Alias和APS-5600A）;產(chǎn)品型號(hào)為CNT SEC-300的色譜柱購自河南奧普斯儀器設(shè)備有限公司（孔徑：300 ，規(guī)格：4.6 mm×150 mm，粒度：5 μm）;產(chǎn)品型號(hào)為FA2004B的電子分析天平（讀數(shù)精度：0.1 mg）購自上海精科天平儀器廠;產(chǎn)品型號(hào)為KQ-250DE的臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 所有對(duì)照品均由上海純優(yōu)生物科技有限公司購入，其中淫羊藿苷對(duì)照品純度≥98%（對(duì)照藥品批號(hào)：489-32-7;對(duì)照品編號(hào)：P0057）、淫羊藿次苷Ⅱ?qū)φ掌芳兌取?5%（對(duì)照藥品批號(hào)：489-32-7;對(duì)照品編號(hào)：P0057）、朝藿定B對(duì)照品純度≥98%（對(duì)照藥品批號(hào)：110623-73-9;對(duì)照品編號(hào)：P0355）、朝藿定C對(duì)照品純度≥98%（對(duì)照藥品批號(hào)：110642-44-9;對(duì)照品編號(hào)：P0356）。HPLC級(jí)色譜純乙腈和HPLC級(jí)色譜純甲醇均購自德國(guó)默克（MERCK）公司（藥品批號(hào)分別為：75-05-8;67-56-1）;HPLC級(jí)色譜純甲酸購自美國(guó)飛世爾（FISHER）公司（藥品批號(hào)：64-18-6）;HPLC級(jí)色譜純甲酸購自美國(guó)天地（ACS）公司（藥品批號(hào)：631-61-8）;本研究中所有的純凈水均由河南中美純水有限公司提供。

1.3 分析藥品 二仙湯：淫羊藿、仙茅、當(dāng)歸、巴戟天均為9 g，黃柏、知母均為6 g。所有藥材均由本院藥房提供。其中淫羊藿采用4個(gè)不同產(chǎn)地的藥材，分別為四川、陜西、湖南、湖北。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 進(jìn)樣體積為1 μL;色譜柱的的溫度控制在40 ℃;流動(dòng)相A以0.1%色譜純甲酸和5 mmol/L的色譜純乙酸銨均勻混合而成;流動(dòng)相B以色譜純甲醇和超純水均勻混合而成，研究中所有高效液相色譜線性梯度洗脫程序均根據(jù)表1進(jìn)行。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置在270 nm時(shí)可以檢測(cè)到較多的吸收峰。

2.2 對(duì)照品溶液配制 采用精確度為十萬分之一的電子分析天平精密分別精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品、淫羊藿次苷Ⅱ?qū)φ掌?、朝藿定B對(duì)照品和朝藿定C對(duì)照品分別各19.87 mg、19.96 mg、11.65 mg、12.03 mg，分別放置在用標(biāo)簽標(biāo)記好4個(gè)對(duì)照品名的10 mL容量瓶中，并用色譜純甲醇定容至容量瓶刻度，配制成所需質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品溶液，最終淫羊藿苷對(duì)照品、淫羊藿次苷Ⅱ?qū)φ掌贰⒊蕉˙對(duì)照品和朝藿定C對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為1.987 g/L、1.996 g/L、1.165 g/L、1.203 g/L。將4種對(duì)照品溶液混合搖勻后，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液配制

2.3.1 二仙湯供試品溶液配制 根據(jù)1.3二仙湯藥物組成的配比加入8倍超純水，煮沸后回流提取濃縮液2 h，分別提取3次后，定容在125 mL的容量瓶中并密閉塞緊瓶蓋，后放于超聲波中進(jìn)一步濃縮提取30 min，最后采用孔徑只有0.2 μm的有機(jī)過濾膜對(duì)二仙湯濃縮液進(jìn)行過濾，所得的續(xù)濾液即為二仙湯供試品溶液。

2.3.2 淫羊藿單味藥供試品溶液配制 根據(jù)1.3二仙湯藥物組成中淫羊藿藥材的用量，加入8倍超純水，煮沸后回流提取濃縮液2 h，分別提取3次后，定容在25 mL的容量瓶中并密閉塞緊瓶蓋，后放于超聲波中進(jìn)一步濃縮提取30 min，最后采用孔徑只有0.2 μm的有機(jī)過濾膜對(duì)二仙湯濃縮液進(jìn)行過濾，所得的續(xù)濾液即為淫羊藿單味藥供試品溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液配制 根據(jù)1.3中除淫羊藿以外的二仙湯藥物組成的配比加入8倍超純水，煮沸后回流提取濃縮液2 h，分別提取3次后，定容在100 mL的容量瓶中并密閉塞緊瓶蓋，后放于超聲波中進(jìn)一步濃縮提取30 min，最后采用孔徑只有0.2 μm的有機(jī)過濾膜不含淫羊藿的二仙湯濃縮液進(jìn)行過濾，所得的續(xù)濾液即為陰性對(duì)照供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 采用HPLC對(duì)混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照供試品溶液、淫羊藿單味藥供試品溶液和二仙湯供試品溶液進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，本研究結(jié)果顯示，二仙湯中淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷對(duì)照品、淫羊藿次苷Ⅱ?qū)φ掌?、朝藿定B對(duì)照品和朝藿定C對(duì)照品均可見良好的分離度，最重要的是這4種成分之間并不存在任何內(nèi)源性的干擾物質(zhì)，顯示各個(gè)成分的專屬性均較好。見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 根據(jù)對(duì)照品溶液配制方法將淫羊藿苷對(duì)照品、淫羊藿次苷Ⅱ?qū)φ掌?、朝藿定B對(duì)照品和朝藿定C對(duì)照品溶液分別根據(jù)從低濃度到高濃度的梯度，配制6個(gè)濃度梯度的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度均測(cè)試3次，記錄色譜峰面積并計(jì)算平均值和繪制回歸方程，方程中縱坐標(biāo)Y是各對(duì)照品的平均峰面積，橫坐標(biāo)X是各對(duì)照品對(duì)應(yīng)的濃度梯度，結(jié)果顯示淫羊藿苷對(duì)照品、淫羊藿次苷Ⅱ?qū)φ掌?、朝藿定B對(duì)照品和朝藿定C對(duì)照品溶液線性關(guān)系考察均顯示良好。見表2。

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批次同一時(shí)間配制的二仙湯供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并換算其各自對(duì)應(yīng)的RSD值，結(jié)果顯示這4個(gè)黃酮類成分的RSD值分別為0.33%、0.64%、0.57%、0.52%，符合當(dāng)RSD值小于3%時(shí)，即說明高效液相色譜儀器的精密度良好。見表3。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇同一份二仙湯供試品溶液，根據(jù)靜置時(shí)間的從短到長(zhǎng)（0、2、4、8、12、24 h）依次檢測(cè)二仙湯中黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并換算各成分的RSD值，結(jié)果顯示這4個(gè)黃酮類成分的RSD值分別為1.09%、1.62%、1.78%、0.41%，符合當(dāng)RSD值小于3%時(shí)，即說明二仙湯供試品溶液在靜置24 h內(nèi)都能保持良好的穩(wěn)定性。見表4。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份同一批次同一制備方法制備的二仙湯供試品溶液，使用同一臺(tái)高效液相色譜儀器重復(fù)測(cè)試該供試品溶液，檢測(cè)二仙湯中黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并換算各成分的RSD值，結(jié)果顯示這4個(gè)黃酮類成分的RSD值分別為2.61%、2.75%、2.48%、1.22%，符合當(dāng)RSD值小于3%時(shí)，即說明二仙湯供試品溶液能夠保持良好的重復(fù)性。見表5。

2.9 回收率試驗(yàn) 在含量已知的二仙湯供試品溶液6份中，每一份均加入不同量的對(duì)照品溶液，混合均勻后，對(duì)混合液和各個(gè)對(duì)照品溶液分別重復(fù)檢測(cè)6次，檢測(cè)二仙湯供試品溶液中黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的平均回收率，結(jié)果顯示這4個(gè)黃酮類成分的平均回收率分別為（96.87±2.15）%、（99.46±1.52）%、（101.64±2.43）%、（99.79±2.31）%，說明采用HPLC法測(cè)定二仙湯供試品溶液中黃酮類成分的含量是可靠的。

2.10 樣品檢測(cè)結(jié)果 比較二仙湯供試品溶液和淫羊藿單味藥材供試品溶液中黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C這4種黃酮類成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二仙湯供試品溶液中淫羊藿黃酮類成分的含量高于淫羊藿單味藥材供試品溶液;從淫羊藿不同產(chǎn)地中黃酮類成分含量的角度比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四川產(chǎn)地的淫羊藿中測(cè)得的黃酮類成分高于其他3個(gè)產(chǎn)地，陜西產(chǎn)地淫羊藿次之，其后為湖北淫羊藿產(chǎn)地，而湖南淫羊藿產(chǎn)地黃酮類成分含量最低。見表6。

3 討論

近年來，二仙湯的相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，其中淫羊藿含有大量的黃酮類成分，本研究欲通過對(duì)淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C等主要黃銅類成分監(jiān)測(cè)并采用HPLC明確各種成分含量，為二仙湯的復(fù)方藥物質(zhì)量控制提供更豐富的研究資料。高效液相色譜法作為常用快捷可靠的液相色譜技術(shù)，為復(fù)雜體系中藥復(fù)方的藥物成分分離分析提供了良好的平臺(tái)。HPLC的穩(wěn)定性十分良好[13-15]，本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，因此本研究采用HPLC測(cè)定二仙湯中4種淫羊藿黃酮類成分能夠把每次測(cè)量的誤差降到最低，進(jìn)一步保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為二仙湯的復(fù)方藥物質(zhì)量控制和相關(guān)新制劑研究提供高可信度的參考依據(jù)。本研究通過比較二仙湯水煎劑和淫羊藿單味藥材水煎劑中淫羊藿黃酮類成分含量，結(jié)果表明二仙湯中淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量均較淫羊藿單位要從水煎劑高，這4種黃酮類成分的含量以朝藿定C最高，淫羊藿苷次之，接著是淫羊藿次苷Ⅱ，而朝藿定B含量最少。本研究結(jié)果闡釋在臨床上二仙湯水煎劑有效保證了復(fù)方中黃酮類成分的含量，能夠最大化實(shí)現(xiàn)臨床療效。另外，本研究有進(jìn)一步選擇淫羊藿常見的4個(gè)不同產(chǎn)地的藥材，經(jīng)過對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四川產(chǎn)地的淫羊藿中測(cè)得的黃酮類成分高于其他3個(gè)產(chǎn)地，陜西產(chǎn)地淫羊藿次之，其后為湖北淫羊藿產(chǎn)地，而湖南淫羊藿產(chǎn)地黃酮類成分含量最低。這4個(gè)產(chǎn)地中四川淫羊藿的黃酮類成分含量最高，可能與該產(chǎn)地的地理位置和氣候等因素有關(guān)。

綜上所述，本研究建立的HPLC同時(shí)測(cè)定二仙湯中淫羊藿黃酮類成分中的4種主要成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量，這一檢測(cè)方法不僅操作過程簡(jiǎn)單便捷，而且方法上具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性[16-17]，能夠指導(dǎo)臨床上二仙湯的復(fù)方藥物質(zhì)量控制和新藥研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

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（2019-03-13收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）