楊華

摘? ?要：主要介紹了水稻品種真實性鑒定室內(nèi)分子檢測的能力驗證方法，探討了聚丙烯酰胺凝膠、QIAGEN瓊脂糖毛細管電泳和熒光毛細管電泳3種不同檢測方法的應(yīng)用分析和比較。各實驗室可以根據(jù)實際情況選擇合適的方法開展能力驗證以及日常的檢測工作。

關(guān)鍵詞：農(nóng)作物;種子質(zhì)量;檢測能力;驗證;品種;真實性;分子檢測

文章編號： 1005-2690（2019）06-0127-03? ? ? ?中圖分類號： S339.31;S511? ? ? ?文獻標志碼： B

農(nóng)作物品種真實性鑒定一直是種子檢測中的重點和難點，因為近年來種子市場上假冒偽劣、套牌侵權(quán)等違法行為屢禁不止，而傳統(tǒng)的檢測方法為田間種植鑒定，其需要在作物整個生長發(fā)育期間，田間觀察其特征特性并與標準樣品進行比對，根據(jù)明顯的性狀差異來鑒定品種真實性，鑒定周期至少為一個生產(chǎn)周期，有時候待鑒定結(jié)果出來時，違法行為的證據(jù)都已經(jīng)過期或者消失，無法快速有效地打擊種子市場上的違法行為。但是近年來隨著分子標記技術(shù)在品種鑒定中的廣泛研究和發(fā)展，這種快速、高效的檢測方法已經(jīng)開始彰顯優(yōu)勢。

2015年5月29日，國家標準化管理委員會批準的國家標準《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程 真實性和品種純度鑒定》第1號修改單規(guī)定，品種真實性或分子身份允許采用SSR和SNP分析標記方法。這一規(guī)定使SSR分子標記法同傳統(tǒng)的田間種植鑒定一樣成為國家標準認可的品種真實性鑒定方法。2016年1月1日修訂后實施的新《種子法》第四十六條中明確規(guī)定，農(nóng)業(yè)、林業(yè)主管部門可以采用國家規(guī)定的快速檢測方法對生產(chǎn)經(jīng)營的種子品種進行檢測，檢測結(jié)果可以作為行政處罰依據(jù)。這款法律條文明確了快速檢測方法的法律地位，至此地方法院在審理種子案件、農(nóng)業(yè)部門在查處假冒侵權(quán)等案件中，可以依據(jù)分子標記快速檢測技術(shù)查處有關(guān)的違法行為。

江蘇省于2014年通過了原農(nóng)業(yè)部資質(zhì)認定，取得了水稻品種真實性室內(nèi)分子檢測的資質(zhì)，成為首批獲得分子檢測資質(zhì)的省級種子質(zhì)量檢測機構(gòu)。檢驗中心自取得資質(zhì)后在2014—2017年種子市場監(jiān)管中，分子檢測技術(shù)發(fā)揮了無可替代的作用，為多起種子案件提供了強有力的技術(shù)支持和保障。為了不斷提高中心的檢測水平，中心技術(shù)人員每年都參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的農(nóng)作物種子品種真實性室內(nèi)檢測能力驗證。本文就2017年參加的水稻品種真實性室內(nèi)分子檢測能力驗證進行了分析和總結(jié)。

1? ?試驗材料

試驗中用到的水稻種子樣品，由能力驗證組織方——全國農(nóng)技推廣中心種子檢驗處提供。共7個種子樣品，分別為對照CK08、CK24和待測樣稻DC036、稻DC037、稻DC038、稻DC039、稻DC040。

2? ?試劑耗材

植物基因組DNA提取試劑盒（DNA secure Plant Kit）天根生物公司;Taq酶（Premix Taq）TAKARA。

3? ?試驗儀器

種子粉碎設(shè)備（SPEX Geno2010 美國）;PCR儀（Agilent）;微量紫外分光光度計（Thermo Scientific ND2000）;聚丙烯酰胺凝膠電泳儀/槽（北京六一/北京君意）;伯樂（Bio-RAD）公司的Gel Dox XR+型號凝膠成像系統(tǒng)進行掃膠成像;瓊脂糖毛細管電泳設(shè)備（QIAxcel Advanced 全自動核酸分析儀）;熒光毛細管電泳設(shè)備（ABI）。

4? ?試驗方法

4.1? ?DNA提取

本試驗采用水稻干種子直接提取的方法，每個樣品取20粒種子的混株樣品，使用粉碎設(shè)備磨碎后，用DNA提取試劑盒提取水稻全基因組DNA，詳細方法見試劑盒說明書。提取的DNA用微量紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋到50 ng/μL備用。

4.2? ?PCR擴增

采用能力驗證指導書中規(guī)定的10對引物進行PCR擴增，內(nèi)容見表1。

反應(yīng)體系為16.5 μL Taq酶混合物，1.5 μL DNA模板，2 μL上下游引物的混合物（其中進行熒光毛細管電泳的引物5’端標記熒光集團）;反應(yīng)程序為94 ℃下預(yù)變性2 min;進行32次擴增反應(yīng)循環(huán)（94 ℃下變性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min）;然后72 ℃下延伸8 min;最后10 ℃恒溫冷卻。

4.3? ?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

根據(jù)行業(yè)標準中非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測的具體方法進行電泳和染色。染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Mage Lab 4.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。

4.4? ?瓊脂糖毛細管電泳檢測

按照儀器操作手冊，將PCR產(chǎn)物放在儀器樣品分析臺上直接進行毛細管電泳分析，并用儀器自帶的分析軟件（QIAxcel ScreenGel）進行數(shù)據(jù)分析。

4.5? ?熒光毛細管電泳檢測

將PCR產(chǎn)物稀釋40倍后，分別吸取1 μL加入到分析儀專用的96孔板中，每個孔分別加入0.1 μL內(nèi)標和8.9 μL去離子甲酰胺，變性處理并離心后放在分析儀上進行電泳，并用Gene Mapper Software 5軟件進行數(shù)據(jù)分析。

5? ?結(jié)果和分析

5.1? ?聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

根據(jù)行業(yè)標準中的方法步驟，以及本實驗室的優(yōu)化，每個檢測位點都得到了清晰電泳圖，以P01和P03兩個位點的圖為例，見圖1。并根據(jù)指紋圖譜對10個位點進行了讀圖分析，得到了最終的結(jié)果，見表2和表3。

5.2? ?QIAGEN瓊脂糖毛細管電泳結(jié)果

本試驗中應(yīng)用的QIAGEN瓊脂糖毛細管電泳是一種新型的瓊脂糖電泳，此方法是通過將溴化乙錠染色的瓊脂糖膠制成一種預(yù)制卡夾微光采集器，片段在卡夾毛細管中移動時通過一系列激光二極管，激發(fā)并檢測信號，信號通過光電倍增管傳至進行數(shù)據(jù)分析的軟件中，通過軟件分析生成模擬的電泳圖譜，圖譜中顯示每條毛細管中片段的帶型，以P01和P03兩個位點的圖為例，見圖2，圖型清晰，便于分析。

5.3? ?毛細管電泳分析

本試驗通過標準中規(guī)定方法和部分步驟優(yōu)化后，在ABI3700基因分析儀器上利用熒光標記的PCR產(chǎn)物進行毛細管電泳分析擴增產(chǎn)物的片段類型和大小，以P01和P03兩個位點的圖為例，見圖3、圖4。圖中顯示兩個對照和5個樣品在這兩個位點上擴增片段的信號強，帶型清晰，具有各自特異的帶型，并且通過軟件分析能得出每個片段的大小數(shù)值。表4為兩個對照品種和4個樣品在P01和P03兩個位點上的片段大小。

5.4? ?能力驗證結(jié)果判定

通過分析3種電泳結(jié)果各自的圖譜或峰值圖，均得到了一致的判定結(jié)果。與對照樣品CK08相比，DC036號樣品10個位點上均無差異;DC038號樣品在P06位點上有1個差異，其他位點無差異;DC037、DC039號樣品只在P02位點上無差異，其他位點均有差異;DC040號樣品與對照樣品在10個位點上均有差異，詳見表2。

與對照樣品CK24相比，DC037號樣品在10個位點上均無差異;DC039號樣品在P05位點上有1個差異，其他位點均無差異;DC036、DC038號樣品只在P02位點上無差異，其他位點均有差異;DC040號樣品與對照樣品在P03和P08兩個位點上無差異，詳見表3。本次能力驗證的結(jié)果經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)機推廣中心判定為合格A等級，表明結(jié)果真確無誤。

6? ?結(jié)論與討論

目前，水稻品種真實性SSR標記鑒定方法中最常用的3種方法分別為聚丙烯酰胺凝膠電泳、QIAGEN瓊脂糖毛細管電泳和ABI熒光毛細管電泳[1，2]。

本研究分別用這3種方法檢測了本年度農(nóng)業(yè)農(nóng)村部分發(fā)的能力驗證樣品，每種方法都得到了清晰、便于分析的膠圖和峰圖，并將3種方法的結(jié)果進行了分析和比對，均得到了一致的檢測結(jié)果。但是3種方法因為原理不同，也存在本身的優(yōu)缺點：聚丙烯酰胺凝膠電泳成本低、結(jié)果直觀，但是操作復雜、耗時長、容易受到人為因素影響、通量也不高;QIAGEN瓊脂糖毛細管電泳方法最簡便，但是分辨率略低;ABI熒光毛細管電泳分辨率高，最高可達1 bp，且通量高，但是成本相對較高，程序較復雜。

各個實驗室可以在工作中根據(jù)實際情況選擇合適的檢驗方法，也可以選擇幾種方法結(jié)合的方式進行試驗，如先用QIAGEN瓊脂糖毛細管電泳方法進行大量樣品的初篩，之后對問題品種用分辨率更高的其他兩種方法進行進一步鑒定，以獲得更加高效、準確的檢測結(jié)果。

參考文獻：

[ 1 ] 劉文彬，許理文，王鳳格，等.基于兩種熒光毛細管電泳平臺篩選評估玉米新型SSR 引物[J].玉米科學，2017，25（2）：24-30.

[ 2 ] 程本義，夏俊輝，龔俊義，等.SSR熒光標記毛細管電泳檢測法在水稻DNA指紋鑒定中的應(yīng)用[J].中國水稻科學，2011，25（6）：672-676.

（收稿日期：2019-05-15）