孫立亭　林添資　景德道　余波　錢(qián)華飛　曾生元　李闖　姚維成　杜燦燦　胡慶峰　周義文　龔紅兵

摘要：【目的】研究多基因聚合對(duì)水稻稻瘟病抗性的效應(yīng)，并開(kāi)發(fā)Pb1基因功能標(biāo)記，為江蘇省培育持久抗稻瘟病品種及提高其育種效率提供理論依據(jù)?！痉椒ā块_(kāi)發(fā)Pb1基因的功能標(biāo)記，并結(jié)合Pita、Pib、Pi54、Pikm和Pizt功能標(biāo)記檢測(cè)2015─2017年參加江蘇省預(yù)試的703份常規(guī)粳稻材料的抗病基因，分析其聚合方式與稻瘟病抗性的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】在Pb1基因編碼區(qū)上游926～1085 bp設(shè)計(jì)1個(gè)存在/缺失標(biāo)記M1，其引物可擴(kuò)增獲得160 bp的片段。703份供試材料中，Pita、Pib和Pi54基因頻率高于Pikm、Pb1和Pizt，雖然抗病頻率（稻瘟病綜合指數(shù)≤5.0的材料所占比例）在2015─2017年呈逐年快速升高趨勢(shì)，但3年間達(dá)中抗及以上等級(jí)的材料所占比例均較低。不含抗病基因的材料11份，綜合指數(shù)≤5.0的材料4份，抗病頻率為36.36%;當(dāng)所含抗病基因數(shù)≤3個(gè)時(shí)，隨著含抗病基因數(shù)的增加，對(duì)應(yīng)的材料數(shù)量、出現(xiàn)頻率和綜合指數(shù)≤5.0的材料數(shù)量均明顯增加，當(dāng)所含抗病基因數(shù)≥4個(gè)時(shí)，隨著含抗病基因數(shù)的增加，對(duì)應(yīng)的材料數(shù)量、出現(xiàn)頻率和綜合指數(shù)≤5.0的材料數(shù)量均明顯降低?？共』驍?shù)越多，抗病頻率越高，當(dāng)抗病基因數(shù)達(dá)6個(gè)時(shí)，抗病頻率達(dá)100.00%，說(shuō)明聚合的抗病基因數(shù)與抗病頻率呈正相關(guān)。3個(gè)抗病基因聚合的最佳方式為：Pi54+Pib+Pb1或Pita+Pib+Pikm。4個(gè)抗病基因聚合的最佳方式為Pita+Pib+Pikm+Pizt或Pita+Pi54+Pib+Pb1?！窘Y(jié)論】開(kāi)發(fā)的Pb1基因功能標(biāo)記可應(yīng)用于水稻稻瘟病抗性育種，以提高選擇效率。多基因聚合能提高水稻稻瘟病抗性，但抗性強(qiáng)弱取決于抗性基因間的互作效應(yīng)，并不是簡(jiǎn)單的累加效應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 稻瘟病;多基因聚合;分子標(biāo)記;抗性育種

中圖分類(lèi)號(hào)： S511.220.32 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）05-0913-11

Abstract：【Objective】Studying the effect of multiple genes polymerization on rice blast resistance could guide bree-ding rice blast resistant varieties and improve breeding efficiency in Jiangsu Province. 【Method】Functional markers of Pb1 was developed， and resistance genes of 703 japonica rices for preliminary experiment in the year of 2015，2016 and 2017 in Jiangsu were detected using functional markers of Pita，Pib，Pi54，Pikm and Pizt，then the correlation between polymerization mode and rice blast resistance was analyzed. 【Result】A presence/deletion marker M1 was designed near 1016 bp upstream of the coding region of Pb1. Its primer could amplify 160 bp fragment. Among the 703 materials， the gene frequency of Pita，Pib and Pi54 was higher than that of Pikm，Pb1 and Pizt. Although the frequency of rice blast resistance （the proportion of materials with composite index of blast ≤5.0） increased rapidly year by year from 2015 to 2017，the moderate resistance and above level ratios were low during the three years. Among the 703 materials tested，11 did not contain resistance genes，of which 4 materials had a composite index ≤5.0 and the resistance frequency of 36.36%. When the number of disease-resistant genes was ≤3，the number of materials，frequency of occurrence and the number of materials whose composite index was ≤5.0 increased greatly with the increase of the number of disease resistant genes. When the number of disease resistant genes was ≥4，the number of materials，the frequency of gene occurrence and the number of materials whose composite index was ≤5.0 decreased greatly with the increase of the number of disease resistant genes.The higher the number of resistance genes，the higher the resistance frequency. When the number of resistance genes reached 6，the resistance frequency reached 100.00%. This indicated that the number of multiple genes polymerization was positively correlated with the resistance frequency. The optimal polymerization mode for three genes was Pi54+Pib+Pb1 or Pita+Pib+Pikm. The optimal polymerization mode for four genes was Pita+Pib+Pikm+Pizt or Pita+Pi54+Pib+Pb1. 【Conclusion】The developed functional markers of Pb1 can be used in rice blast resistance breeding to improve selection efficiency. Polygenic polymerization can improve the resistance level of rice blast，but the resistance depends on the interaction between resistant genes，not simply the cumulative effect.

Key words： rice blast; multiple genes polymerization; molecular marker; resistance breeding

0 引言

【研究意義】稻瘟病是由子囊菌（Magnaporthe oryzae）引發(fā)的一種嚴(yán)重的水稻病害，對(duì)水稻產(chǎn)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響（Khush and Jena，2009;Skamnioti and Gurr，2009;劉萬(wàn)才等，2016）。長(zhǎng)期實(shí)踐證明，培育抗病品種是最環(huán)保、最經(jīng)濟(jì)有效的方法（Koide et al.，2009;Miah et al.，2013）。水稻對(duì)稻瘟病的抗性可分為水平抗性和垂直抗性，其中垂直抗性具有很強(qiáng)的小種專(zhuān)化性，易隨小種的變化而喪失，尤其是含有單個(gè)主效抗病基因的品種（Mackill and Bonman，1992;孫大元等，2017）。水稻聚合多個(gè)抗病基因后其植株抗譜和抗性均得到提高，是獲得持久抗性的有效方法之一（Hittalmani et al.，2000）。因此，分析我國(guó)江蘇省多基因聚合對(duì)稻瘟病抗性的效應(yīng)，對(duì)改良現(xiàn)有品種的稻瘟病抗性具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】隨著分子生物學(xué)和基因定位技術(shù)的發(fā)展，水稻稻瘟病抗性基因的研究取得長(zhǎng)足進(jìn)展。為開(kāi)展高效的分子育種，對(duì)分子標(biāo)記進(jìn)行篩選即能實(shí)現(xiàn)性狀篩選，其原因是一個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)代表一個(gè)特定的等位基因，并與該基因控制的性狀相聯(lián)系，水稻抗稻瘟病基因的克隆為開(kāi)發(fā)基因功能標(biāo)記提供了基礎(chǔ)和前提（Andersen and Lǖbberstedt，2003）。目前，成功克隆的稻瘟病抗性基因有Pib（Wang et al.，1999）、Pita（Bryan et al.，2000）、Pi5（Jeon et al.，2003）、Pid2（Chen et al.，2006）、Piz-t（Zhou et al.，2006）、Pi2（Zhou et al.，2006）、Pi9（Qu et al.，2006）、Pi37（Lin et al.，2007）、Pi21（Fukuoka et al.，2009）、Pid3（Shang et al.，2009）、Pb1（Hayashi et al.，2010b）、Pit（Hayashi et al.，2010a）、Pish（Takahashi et al.，2010）、Pi2（Chen et al.，2011）、Pia（Okuyama et al.，2011）、Pik-p（Yuan et al.，2011）、Pikm（Zhai et al.，2011）、Pik（Ashikawa et al.，2012）、Pik-h/Pi54（Das et al.，2012）、Pi1（Hua et al.，2012）、Pi56（Liu et al.，2013）、Pi63（Xu et al.，2014）和Pigm（Deng et al.，2017）等。其中Pita基因位于第12條染色體上，編碼細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白，該蛋白與稻瘟病菌的無(wú)毒基因AVR-Pita表達(dá)產(chǎn)物相互作用引發(fā)抗病反應(yīng)（Bryan et al.，2000）;Pib基因定位于第2條染色體上，對(duì)日本大多數(shù)稻瘟病菌小種有抗性，對(duì)我國(guó)的菌株ZB13和ZC15也有抗病反應(yīng)（Wang et al.，1999）;pik座位上有5個(gè)等位基因，分別為Pi-l、Pik-h、Pi54、Pikm和Pikp基因，其中，Pi54基因?qū)儆诳共』虻腃C-NBS-LRR家族，對(duì)稻瘟病菌具有廣譜抗性（Das et al.，2012），Pikm是由兩個(gè)緊密連鎖的具有獨(dú)立功能NBS-LRR類(lèi)基因（Pikm1-TS和Pikm2-TS）組成（Ashikawa et al.，2008）;Pizt基因位于第6條染色體上的Piz位點(diǎn)，屬于NBS-LRR類(lèi)基因，其編碼1033個(gè)氨基酸，含1個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）和3個(gè)富亮氨酸重復(fù)區(qū)（LRR）（Zhou et al.，2006）。大量研究表明，聚合多個(gè)抗性基因是培育廣譜、持久抗性品種的一條有效途徑。范方軍等（2014）對(duì)2012年審定的江蘇水稻品種進(jìn)行抗病基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)水稻品種含有稻瘟病抗性基因Pita、Pib、Pi54和Pikm。劉斌等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，云南省56個(gè)主栽水稻品種中Pita2、pi5、Pi9和Pizt基因出現(xiàn)頻率較高，且對(duì)稻瘟病抗性良好。張善磊等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外238個(gè)粳稻品種（系）中同時(shí)含有Pita、Pi5和Pikm基因的品種（系）表現(xiàn)出較強(qiáng)的穗頸瘟抗性。黃乾龍等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，重慶自育骨干親本攜帶抗病基因及聚合方式不同，稻瘟病抗性均存在差異。【本研究切入點(diǎn)】目前，稻瘟病抗性基因Pita、Pib、Pi54、Pikm、Pb1和Pizt等在江蘇省的聚合效應(yīng)仍不清楚。因此，有必要對(duì)江蘇省常規(guī)粳稻的抗病基因與抗性效應(yīng)進(jìn)行分析，總結(jié)基因聚合模式與稻瘟病抗性間的關(guān)系，并根據(jù)基因型和抗病性制定育種策略?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)開(kāi)發(fā)Pb1基因功能標(biāo)記，結(jié)合前人已開(kāi)發(fā)的Pita、Pib、Pi54、Pikm和Pizt基因功能標(biāo)記，對(duì)2015—2017年江蘇省703個(gè)常規(guī)粳稻預(yù)試品種（系）進(jìn)行抗病基因檢測(cè)，并測(cè)定其稻瘟病抗性，分析抗病基因聚合方式與稻瘟病抗性的相關(guān)性，為江蘇省抗病品種（系）的合理布局、培育持久抗病品種（系）及提高育種效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為2015─2017年參加江蘇省預(yù)試的703常規(guī)粳稻材料。其中，2015年參加江蘇省預(yù)試的材料222份，包括中熟中粳79份、遲熟中粳93份、早熟晚粳50份;2016年參加江蘇省預(yù)試的材料221份，包括中熟中粳83份、遲熟中粳89份、早熟晚粳49份;2017年參加江蘇省預(yù)試的材料260份，包括中熟中粳92份、遲熟中粳104份、早熟晚粳64份，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;Taq DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀（Biometra TProfessional PCR）、電泳槽（DYCZ-30C）、電泳儀（BIO-RAD）和高通量組織研磨儀（DHS TL2020）。

1. 2 Pb1基因功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證

Hayashi等（2010b）對(duì)日本品種St. No1中的Pb1和P5基因進(jìn)行克隆及分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pb1位于一個(gè)以60 kb為單位的串聯(lián)重復(fù)序列中，且Pb1位于第二個(gè)重復(fù)基序中，與第一個(gè)重復(fù)基序的P5相對(duì)應(yīng)，Pb1與P5均具有穗瘟抗性，但Pb1的穗瘟抗性高于P5，兩個(gè)基因的抗穗瘟差異取決于Pb1基因編碼區(qū)上游1～2056 bp的特有序列?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，通過(guò)NCBI搜索獲得Pb1基因（登錄號(hào)AB570371.1）和P5基因（登錄號(hào)LOC_Os11g38480）及感病品種日本晴等位基因Os11g0598500（登錄號(hào)LOC_Os11g38580）。將P5基因編碼區(qū)上游序列和日本晴等位基因Os11g0598500Pb1與Pb1基因編碼區(qū)上游序列進(jìn)行序列比對(duì)，尋找差異位點(diǎn)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異引物，并利用鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻18號(hào)和日本晴進(jìn)行驗(yàn)證。

1. 3 PCR擴(kuò)增

水稻基因組DNA提取采用SDS法（孫立亭等，2017）。根據(jù)等位基因PCR擴(kuò)增原理，針對(duì)Pita、Pi54、Pib、Pikm、Pb1和Pizt抗感等位基因序列的差異設(shè)計(jì)特異引物（表1）。以基因組DNA為模板，PCR克隆稻瘟病抗性基因標(biāo)記。反應(yīng)體系10.0 μL：1.2 μL 10×Taq Buffer，50 ng/μL基因組DNA 1.5 μL，2 mmol/L上、下游引物各0.5 μL，1 mmol/L dNTP 0.3 μL，1000 U Taq DNA聚合酶0.1 μL，ddH2O補(bǔ)足至10.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。Pita和Pib基因標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，其他基因標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。取PCR產(chǎn)物2.0 μL，以100 bp-ⅠDNA Ladder作為DNA Marker，在240 V恒壓下電泳1 h。最后，采用銀染法顯示DNA條帶。

1. 4 抗病基因檢測(cè)

根據(jù)片段大小判斷抗病基因功能標(biāo)記。利用Pita-F/Pita-R引物可擴(kuò)增出1042 bp條帶，同時(shí)NPita-F/NPita-R引物擴(kuò)增不出條帶，則判定為該材料含有Pita基因。利用Pib-F/Pib-R引物可擴(kuò)增出365 bp條帶，同時(shí)NPib-F/NPib-R擴(kuò)增不出條帶，則判定為該材料含Pib基因。利用A-F/A-R引物可擴(kuò)增出160 bp條帶，同時(shí)G-F/G-R引物擴(kuò)增不出條帶，則該材料含Pizt基因。利用Pi54-F/Pi54-R引物擴(kuò)增，若擴(kuò)增片段為216 bp，則判定為該材料含Pi54基因，若擴(kuò)增片段為359 bp，則判定為該材料不含Pi54基因。利用Pikm由Pikm1-F/Pikm1-R和Pikm2-F/Pikm2-R兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，若Pikm1-F/Pikm1-R擴(kuò)增片段為174 bp，則判定該材料含Pikm1基因，若擴(kuò)增片段為213 bp則判定不含Pikm1基因;若Pikm2-F/Pikm2-R擴(kuò)增片段為290 bp，則判定該材料含Pikm2基因，若擴(kuò)增片段為332 bp，則判定該材料不含Pikm2基因。利用M1-F/M1-R引物擴(kuò)增，若擴(kuò)增片段為160 bp，則判定該材料含Pb1基因，若無(wú)條帶，則判定該材料不含Pb1基因。

1. 5 稻瘟病抗性鑒定與抗病頻率評(píng)價(jià)

供試材料的抗性鑒定綜合指數(shù)評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。鑒定結(jié)果參考《江蘇省水稻新品種中間試驗(yàn)總結(jié)匯編（2015─2017）》江蘇省種子管理站，2015，2016，2017）。綜合指數(shù)=（葉瘟病級(jí)×25%+穗瘟發(fā)病率病級(jí)×25%+穗瘟損失指數(shù)病級(jí)×50%。

2 結(jié)果與分析

2. 1 稻瘟病抗性基因Pb1功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)比對(duì)Pb1和P5基因的編碼區(qū)上游1～1016 bp序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pb1基因在356 bp處比P5基因多17 bp，在1 bp處比P5基因少17 bp，但日本晴等位基因Os11g0598500不含此段序列（圖1）。通過(guò)比對(duì)Pb1基因編碼區(qū)上游1017～2056 bp與日本晴等位基因Os11g0598500序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pb1基因與日本晴基因組序列存在31處單堿基替換，其他序列完全匹配（圖2）。

本研究在Pb1基因編碼區(qū)上游1016 bp附近設(shè)計(jì)1對(duì)存在/缺失標(biāo)記M1（表1），該標(biāo)記具體位于Pb1基因編碼區(qū)上游926～1085 bp，其引物可擴(kuò)增160 bp片段，若材料不含Pb1基因則擴(kuò)增不出該片段，如圖3所示鎮(zhèn)稻88和鎮(zhèn)稻18號(hào)（抗稻瘟病）均能擴(kuò)增出160 bp的片段，而日本晴擴(kuò)增不出對(duì)應(yīng)的片段。Pb1基因的供體為Modan，而鎮(zhèn)稻88含有Modan血緣且抗稻瘟病，測(cè)序結(jié)果表明，鎮(zhèn)稻88中含有Pb1基因（圖4和圖5）。說(shuō)明該功能標(biāo)記可特異性檢測(cè)Pb1基因。

2. 2 抗性基因檢測(cè)及其分布情況

利用Pita、Pib、Pi54、Pikm、Pizt和Pb1等6個(gè)抗性基因的功能標(biāo)記對(duì)703份供試材料進(jìn)行抗性基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含Pita、Pi54、Pib、Pikm、Pb1和Pizt基因的材料比例在2015─2017年發(fā)生明顯變化，2015年分別為51.8%、40.1%、75.2%、20.7%、23.0%和22.1%，2016年分別為62.4%、53.4%、83.7%、24.9%、31.7%和27.1%，2017年分別為69.6%、54.6%、83.5%、18.8%、26.9%和22.3%（圖6）?？梢?jiàn)，2015—2017年江蘇省預(yù)試材料中Pita、Pib和Pi54基因頻率高于Pikm、Pb1和Pizt。

2. 3 稻瘟病的抗性鑒定結(jié)果

由表3可知，2015─2017年未鑒定出高抗材料，2015年抗病材料比例為4.05%，2016和2017年抗病材料均為0，2017年中抗材料比例（28.46%）明顯高于2015年（18.02%）和2016年（10.86%），2015─2017年中感材料比例逐年升高，但感病和高感材料比例有所降低。整體來(lái)看，雖然抗病頻率在2015─2017年呈逐年快速升高趨勢(shì)，但3年間達(dá)中抗及以上等級(jí)的材料所占比例均偏低。

2. 4 抗病基因與綜合病指的相關(guān)性分析結(jié)果

江蘇省品種審定對(duì)稻瘟病的抗性要求綜合指數(shù)≤5.0，因此，以綜合指數(shù)5.0為界限研究抗病基因與稻瘟病抗性的關(guān)系。由表4可知，不含抗病基因的材料11份，綜合指數(shù)≤5.0的材料4份，抗病頻率為36.36%。當(dāng)所含抗病基因數(shù)≤3個(gè)時(shí)，隨著含抗病基因數(shù)的增加，對(duì)應(yīng)的材料數(shù)量、出現(xiàn)頻率和綜合指數(shù)≤5.0的材料數(shù)量均明顯增加;當(dāng)所含抗病基因數(shù)≥4個(gè)時(shí)，隨著抗病基因數(shù)的增加，對(duì)應(yīng)的材料數(shù)量、出現(xiàn)頻率和綜合指數(shù)≤5.0的材料數(shù)量均明顯降低?？共』驍?shù)越多，抗病頻率越高，當(dāng)抗病基因數(shù)達(dá)3個(gè)時(shí)，抗病頻率達(dá)69.93%，當(dāng)抗病基因數(shù)達(dá)6個(gè)時(shí)，抗病頻率達(dá)100.00%，表明抗病基因數(shù)與抗病頻率呈正相關(guān)。703份供試材料中，含有5和6個(gè)抗病基因的出現(xiàn)頻率較低，僅為1.85%和0.71%，因此本研究進(jìn)一步分析3和4個(gè)抗病基因聚合方式與稻瘟病抗性的相關(guān)性。

2. 5 3個(gè)抗病基因的聚合效應(yīng)分析結(jié)果

3個(gè)抗病基因的聚合效應(yīng)如表5所示。703份供試材料中含有3個(gè)抗病基因的材料286份，其中稻瘟病綜合指數(shù)≤5.0的材料有200份，抗病頻率為69.93%。不同抗病基因聚合方式的抗病頻率存在明顯差異，其中抗病頻率大于69.93%的聚合方式有7種，從高到低依次為：Pita+Pikm+Pizt=Pita+Pb1+Pizt=Pi54+Pib+Pb1>Pita+Pib+Pikm>Pita+Pib+Pizt>Pi54+Pib+Pikm>Pita+Pi54+Pikm，這7種聚合方式的出現(xiàn)頻率從高到低依次為：Pita+Pib+Pikm>Pita+Pib+Pizt>Pi54+Pib+Pikm>Pi54+Pib+Pb1>Pita+Pi54+Pikm> Pita+Pikm+Pizt>Pita+Pb1+Pizt。綜上所述，抗病頻率最高且出現(xiàn)頻率相對(duì)較高的基因聚合方式為Pi54+Pib+Pb1，出現(xiàn)頻率最高且抗病頻率相對(duì)較高的基因聚合方式為Pita+Pib+Pikm，即3個(gè)抗病基因聚合的最佳方式為Pi54+Pib+Pb1或Pita+Pib+Pikm。

2. 6 4個(gè)抗病基因的聚合效應(yīng)分析結(jié)果

4個(gè)抗病基因的聚合效應(yīng)見(jiàn)表6。703份供試材料中含4個(gè)抗病基因的材料107份，其中稻瘟病綜合指數(shù)≤5.0的材料79份，抗病頻率為73.83%?？共☆l率大于73.83%的聚合方式有6種，從高到低依次為：Pita+Pib+Pikm+Pizt=Pita+Pib+Pikm+Pb1=Pita+Pi54+Pikm+Pb1>Pita+Pi54+Pib+Pizt>Pita+Pi54+Pib+Pikm>Pita+Pi54+Pib+Pb1，這6種聚合方式的出現(xiàn)頻率由高到低依次為：Pita+Pi54+Pib+Pb1>Pita+Pi54+Pib+Pikm>Pita+Pib+Pikm+Pizt>Pita+Pi54+Pib+Pizt>Pita+Pib+Pikm+Pb1>Pita+Pi54+Pikm+Pb1。綜上所述，抗病頻率最高且出現(xiàn)頻率相對(duì)較高的基因聚合方式為Pita+Pib+Pikm+Pizt，出現(xiàn)頻率最高且抗病頻率相對(duì)較高的基因聚合方式為Pita+Pi54+Pib+Pb1，即4個(gè)抗病基因聚合的最佳方式為Pita+Pib+Pikm+Pizt或Pita+Pi54+Pib+Pb1。

3 討論

傳統(tǒng)的水稻抗病育種是采用雜交、回交或復(fù)交等手段，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且通常達(dá)不到預(yù)期目的，但分子標(biāo)記輔助選擇育種可快速鑒定材料中是否含有抗性基因，且不受水稻生育期和環(huán)境的影響（宋兆強(qiáng)等，2017;肖宇龍等，2018）。分子標(biāo)記分為連鎖標(biāo)記和功能標(biāo)記，應(yīng)用連鎖標(biāo)記常達(dá)不到育種目的，且連鎖標(biāo)記可能受遺傳背景的限制，無(wú)法應(yīng)用于非多態(tài)群體（Fujii et al.，2000）。Pb1基因是一種來(lái)自秈稻品種Modan的抗性基因，可介導(dǎo)水稻成株期持久的穗瘟病抗性（Hayashi et al.，2010）。有關(guān)Pb1基因分子標(biāo)記的前人研究多集中在連鎖標(biāo)記（Fujii et al.，2000），但其選擇效率不高且應(yīng)用具有局限性。本研究開(kāi)發(fā)了Pb1基因的功能標(biāo)記并進(jìn)行驗(yàn)證，可將其應(yīng)用于水稻稻瘟病抗性育種，提高選擇效率。

目前，大量水稻稻瘟病基因被定位及克隆，并開(kāi)發(fā)出一批稻瘟病基因功能標(biāo)記，其中Pita、Pib、Pikm和Pi54稻瘟病抗性基因及其功能標(biāo)記已廣泛存在于江蘇省水稻品種（系）中（范方軍等，2014）。本研究對(duì)2015─2017年703份江蘇省預(yù)試材料抗病基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pita、Pib和Pi54基因分布最廣，為江蘇省近年主要的稻瘟病抗性基因，但稻瘟病的抗性鑒定結(jié)果顯示，2015─2017年達(dá)中抗及以上等級(jí)的比例偏低，表明Pita、Pib和Pi54基因不能滿足水稻對(duì)稻瘟病的抗性需求，需聚合更多抗病基因才能提高水稻持久抗稻瘟病能力。

多基因聚合并不是單個(gè)抗病基因抗譜的簡(jiǎn)單累加，而是抗性基因間極顯著的互作效應(yīng)（劉士平等，2003）。因此，多基因聚合育種的前提是了解抗性資源的基因遺傳背景，明確基因聚合類(lèi)型。本研究對(duì)2015─2017年江蘇省預(yù)試材料所含抗病基因數(shù)與稻瘟病抗性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病基因數(shù)與抗病頻率呈正相關(guān)，但含5和6個(gè)抗病基因的材料較少，出現(xiàn)頻率較低，因此本研究進(jìn)一步分析3和4個(gè)抗病基因的聚合方式與稻瘟病抗性的相關(guān)性。由于3和4個(gè)基因聚合方式存在多樣化，導(dǎo)致每種聚合方式的材料數(shù)量偏低，出現(xiàn)頻率較低，因此，選擇抗病基因聚合的最佳方式時(shí)既要考慮各聚合方式的抗病頻率又要考慮其出現(xiàn)頻率，最終確定3個(gè)抗病基因聚合的最佳方式為Pi54+Pib+Pb1或Pita+Pib+Pikm，4個(gè)抗病基因聚合的最佳方式為Pita+Pib+Pikm+Pizt或Pita+Pi54+Pib+Pb1。此外，由于抗性基因聚合方式Pita+Pi54+Pib+Pizt和Pita+Pi54+Pib+Pizt/Pikm的抗病頻率均達(dá)80.00%以上，因此這兩種基因聚合方式也可供育種工作者參考。

本研究中6個(gè)抗病基因均不含的材料有11份，其中有2份表現(xiàn)出中抗，可能是由于該品種（系）含有大量其他廣譜抗性基因。在今后的研究中，應(yīng)對(duì)更多的抗性基因進(jìn)行定位及克隆，并開(kāi)發(fā)出其特異性功能標(biāo)記，建立完整的抗稻瘟病水稻資源抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用于水稻分子標(biāo)記輔助選擇育種，以提高水稻稻瘟病抗性。

4 結(jié)論

開(kāi)發(fā)的Pb1基因功能標(biāo)記可應(yīng)用于水稻稻瘟病抗性育種，以提高選擇效率。多基因聚合能提高水稻稻瘟病抗性，聚合的抗病基因數(shù)與抗病頻率呈正相關(guān)，但稻瘟病抗性取決于抗性基因間的互作效應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）