關(guān)曉溪　隋常玲　胡海軍　吳亞男　吳燕

摘要：【目的】探討弱光脅迫對煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)及相關(guān)基因表達(dá)的影響，為后續(xù)開展煙草遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳宰匀还猓?2000 lx）為對照（CK），設(shè)T1（7500 lx）、T2（4500 lx）和T3（2500 lx）3個弱光脅迫處理，于煙苗生長至大十字期時隨機(jī)取樣測定不同光照處理下煙草幼苗的抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測調(diào)控響應(yīng)光信號內(nèi)源物質(zhì)相關(guān)基因的差異表達(dá)模式，并分析基因表達(dá)對脅迫抗性的影響?！窘Y(jié)果】一定程度的弱光（7500和4500 lx）脅迫可使煙苗葉片的脯氨酸（Pro）含量上升，可溶性蛋白含量下降，丙二醛（MDA）含量升高，超氧陰離子產(chǎn)生速率提高，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性提高;而重度弱光（2500 lx）脅迫導(dǎo)致抗氧化酶活性大幅度下降，證明重度弱光導(dǎo)致煙苗生長過弱，其體內(nèi)的防御酶系統(tǒng)不足以抵抗逆境脅迫。在此過程中，煙草生長素早期反應(yīng)基因GH3.6、過氧化物酶類似物基因peroxidase P7-like和細(xì)胞色素基因P450的表達(dá)均在輕度弱光（7500 lx）脅迫時下調(diào)，在重度弱光（2500 lx）脅迫時進(jìn)一步下調(diào);抗病蛋白基因RGA3在重度弱光脅迫下顯著下調(diào)（P<0.05）?！窘Y(jié)論】一定程度的弱光脅迫能激活煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)，抑制幼苗內(nèi)源物質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，推測其參與了煙草的光信號應(yīng)激反應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 煙草幼苗;弱光脅迫;生長發(fā)育;基因表達(dá)

中圖分類號：S572.01 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-0957-07

Abstract：【Objective】The effect of low light intensity stress on tobacco seedlings antioxidant system and expression of related genes were explored to provide scientific basic for tobacco genetic improvement in the future. 【Method】Taking natural light（12000 lx） as control（CK），three low light stress treatments T1（7500 lx），T2（4500 lx） and T3（2500 lx） were set up. Antioxidant system indexes of randomly sample of tobacco seedlings during the big cross period in different light treatments were determined. Then real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） method was used to analyze the expression patterns of genes involved in endogenous substances responding to low light intensity stress in tobacco seedlings. Finally，the influence of gene expressions on stress resistance was also analyzed. 【Result】A certain degree of low light stress（7500 and 4500 lx）initiated a dramatic increase of the ?proline（Pro） and malonaldehyde（MDA） contents in tobacco leaves，superoxide anion production rate and antioxidant enzyme activity，including superoxide dismutase（SOD），peroxidase（POD） and catalase（CAT），while a decrease of soluble protein content. However，serious stress（2500 lx） led to antioxidant enzyme activity decrease to a very low level，which proved that serious light stress led to the weak growth of the seeding，and the internal defensive enzyme system was insufficient to resist stress. In this process，the expression of auxin early response gene GH3.6，peroxidase analog gene peroxidase P7-like and cytochrome gene P450 were all down-regulated under mild low light stress（7500 lx），further down-regulated under severe low light stress（2500 lx），and disease resistance protein（RGA3） was down-regulated significantly under severe low light stress（P<0.05）. 【Conclusion】The results show that a certain degree of low light stress activates tobacco seedlings antioxidant system and inhibits the expression of these genes，which might be involved in the light signal stress response in tobacco.

Key words： tobacco seeding; low light intensity stress; development and growth; gene expression

0 引言

【研究意義】煙草（Nicotiana tabacum L.）為喜光作物。貴州是我國西南煙草種植區(qū)的重要組成部分，也是重要的優(yōu)質(zhì)烤煙產(chǎn)地，擁有得天獨厚的生態(tài)環(huán)境;但貴州地處我國西南部，全年太陽輻射和日照時數(shù)較少，且冬季育苗時通常選擇設(shè)施育苗，在保證溫度條件的同時加劇了弱光脅迫作用，直接影響到煙苗品質(zhì)。已有研究表明，一定程度的弱光脅迫會引起植物抗氧化酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性升高，同時引起脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量的顯著響應(yīng)（Iriti and Faoro，2009）。因此，探討弱光脅迫對煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響和相關(guān)基因的表達(dá)，對煙草的抗性育苗及貴州烤煙生產(chǎn)的發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，有關(guān)弱光脅迫對植物光合、生理生化等影響的研究多集中在低溫弱光兩因素脅迫，研究對象多以設(shè)施蔬菜幼苗為主，包括辣椒和番茄等（張淑杰等，2014;王春萍等，2015;王勤禮等，2015;李雅潔等，2018）。侯偉等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，低溫弱光脅迫下西瓜幼苗的MDA含量上升，SOD和POD活性先上升后下降，CAT活性持續(xù)下降。馬曉麗（2015）研究發(fā)現(xiàn)，隨著光照強(qiáng)度減弱，大白菜幼苗的抗氧化酶活性整體呈升高趨勢，同時結(jié)合干旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)其過氧化氫（H2O2）和MDA含量并未發(fā)生變化，抗氧化酶活性也維持原有水平。圍繞弱光下植物抗氧化系統(tǒng)的相應(yīng)響應(yīng)，何靜雯等（2018）對弱光脅迫下葡萄抗氧化酶系統(tǒng)及相關(guān)基因表達(dá)的研究表明，隨著脅迫程度的加深，植株葉片中CAT、SOD和POD活性先升高后快速下降，與可溶性蛋白含量變化一致，Pro和MDA含量與脅迫程度呈正相關(guān)，MYC2和TRX基因表達(dá)先上調(diào)后下降;劉新等（2018）研究表明，隨光強(qiáng)減弱，金銀花葉片的SOD、CAT和POD活性先升后降，MDA含量增加;羅亢等（2018）研究表明，耐弱光脅迫型晚稻品種的葉片在弱光脅迫下能維持較高的CAT和SOD活性，POD活性差異不顯著。關(guān)于弱光脅迫對煙草生理特性的研究多集中于成苗移栽后的生長和品質(zhì)調(diào)查（倪國仕等，2014;李正付等，2016），而有關(guān)苗期抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)研究較少。煙草苗期在逆境脅迫下極易引發(fā)病害，抗病基因同源物（RGA）參與植物抗病反應(yīng)過程，目前多集中于基因克隆和結(jié)構(gòu)分類研究（Meyers et al.，2003;袁清華等，2014）。GH3（Gretchen Hagen 3）基因是一類生長素早期響應(yīng)基因家族，響應(yīng)參與生長素途徑相關(guān)的早期脅迫反應(yīng)（Lavy and Estellle，2016）。細(xì)胞色素P450參與植物多種代謝活動，且在此過程中產(chǎn)生一些增強(qiáng)抵御逆境脅迫及病蟲害的次生代謝產(chǎn)物。Fu等（2009）利用基因組學(xué)分析煙草P450基因家族的某些成員表現(xiàn)組織特異性表達(dá)，推測其與煙草抗性相關(guān)?？梢?，這些基因?qū)τ谔岣邿煵菘鼓嫘跃哂兄匾饬x?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對弱光脅迫下煙草苗期抗氧化物質(zhì)的調(diào)查，尤其是有關(guān)特異性調(diào)控?zé)煵蓓憫?yīng)弱光脅迫的內(nèi)源物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)分析的研究尚無報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以烤煙品種云煙87為試驗材料，于煙苗大十字期隨機(jī)取樣測定不同光照處理煙苗的抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測調(diào)控響應(yīng)光信號內(nèi)源物質(zhì)相關(guān)基因的差異表達(dá)模式，并分析基因表達(dá)對脅迫抗性的影響，探討弱光脅迫對煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響及相關(guān)基因表達(dá)，為后續(xù)開展煙草遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗在遵義師范學(xué)院人工氣候室進(jìn)行。供試烤煙品種為云煙87（貴州省遵義市煙草公司遵義縣樂山煙草科技園提供），采用16×10穴盤漂浮育苗。

1. 2 試驗方法

以自然光（12000 lx）為對照（CK），由人工氣候室提供相應(yīng)環(huán)境條件，設(shè)T1（7500 lx）、T2（4500 lx）和T3（2500 lx）3個弱光脅迫處理，光周期設(shè)定12 h/12 h（晝/夜），培養(yǎng)溫度為28 ℃/25 ℃（晝/夜）。每處理3次重復(fù)。于煙苗大十字期隨機(jī)取樣測定煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo);取T1和T3處理幼苗葉片進(jìn)行qRT-PCR檢測。其他管理參照常規(guī)育苗方法。

1. 3 測定項目及方法

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定;MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定;Pro含量采用茚三酮顯色法測定;超氧陰離子產(chǎn)生速率采用羥胺氧化法測定;SOD活性采用NBT法測定;CAT活性采用過氧化氫法測定;POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定。

相關(guān)基因表達(dá)qRT-PCR分析選用的植物總RNA提取試劑盒、FastQuant RT Super Mix試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，方法參照試劑盒說明?；谘芯繄F(tuán)隊前期構(gòu)建的煙草幼苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲取調(diào)控抗性內(nèi)源物質(zhì)相關(guān)目的基因序列信息，應(yīng)用DNAMAN軟件設(shè)計目的基因表達(dá)qRT-PCR分析特異引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。參照天根Talent熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）的方法，參考BIO-RAD公司CFX Connect Real-Time System的qRT-PCR程序進(jìn)行qRT-PCR檢測。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，進(jìn)行40個循環(huán)。

1. 4 統(tǒng)計分析

利用Excel 2007和SPSS 20.0進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和作圖，采用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同光照處理對煙苗Pro和可溶性蛋白含量的影響

Pro是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，逆境脅迫可使Pro在植物體內(nèi)大量積累。由圖1-A可看出，隨著光照強(qiáng)度的減弱，煙苗葉片的Pro水平迅速增加，光照強(qiáng)度為4500 lx（T2處理）時Pro含量達(dá)最大值，為104.5 μg/gFW;光照強(qiáng)度繼續(xù)減弱至2500 lx（T3處理）時，煙苗葉片的Pro含量則出現(xiàn)大幅度下降，顯著低于其他處理（P<0.05，下同）。由此可知，一定程度的弱光誘導(dǎo)可顯著上調(diào)煙苗葉片的Pro含量，光照強(qiáng)度過低反而會導(dǎo)致Pro含量大幅度衰減，可能是由于幼苗生長過弱所導(dǎo)致。

可溶性蛋白是植物體內(nèi)一種重要的結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，不良環(huán)境會降低其在植物體內(nèi)的含量，影響植物正常的代謝平衡。由圖1-B可看出，隨著光照強(qiáng)度的持續(xù)減弱，煙苗葉片的可溶性蛋白含量顯著下降，光照強(qiáng)度為2500 lx（T3處理）時達(dá)最低值，且各處理間差異均達(dá)顯著水平。

2. 2 不同光照處理對煙苗MDA含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

逆境脅迫會使細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一;多種不良環(huán)境還會導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧與自由基，其含量的積累能反映植物受外界環(huán)境脅迫的程度。由圖2可看出，光照強(qiáng)度減弱使煙苗葉片的MDA含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率均持續(xù)上升;光照強(qiáng)度為4500 lx（T2處理）時，兩個指標(biāo)均較CK顯著升高;光照強(qiáng)度為2500 lx（T3處理）時，二者均達(dá)最大值。由此可見，弱光脅迫可導(dǎo)致煙苗葉片內(nèi)MDA積累量顯著升高，超氧陰離子產(chǎn)生速率也隨弱光脅迫程度的加深而加快。

2. 3 不同光照處理對煙苗抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)的影響

抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)能清除逆境脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧與自由基，緩解逆境傷害。SOD是保護(hù)酶系統(tǒng)的第一道防線，可歧化自由基和活性氧為H2O2，CAT和POD是清除H2O2的保護(hù)酶。由圖3可看出，光照強(qiáng)度減弱使煙苗葉片的抗氧化酶活性迅速增加;與CK相比，T1和T2處理顯著上升，且均在T2處理達(dá)最大值;但光照強(qiáng)度繼續(xù)減弱時，3種抗氧化酶活性均出現(xiàn)較大幅度下降。由此可知，一定程度的弱光刺激會顯著提高煙苗體內(nèi)的SOD、CAT和POD活性，但光照強(qiáng)度過低會抑制保護(hù)酶系統(tǒng)的各種酶活性，出現(xiàn)此情況的原因可能是弱光導(dǎo)致植株生長過弱，抗氧化保護(hù)系統(tǒng)酶活性過低，削弱了植株的抗氧化能力。

2. 4 弱光脅迫下煙草幼苗內(nèi)源物質(zhì)相關(guān)基因的差異表達(dá)

取T1和T3處理下大十字期煙草幼苗葉片分析其內(nèi)源物質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)情況。由圖4可知，煙草生長素早期反應(yīng)基因GH3.6、過氧化物酶類似物基因peroxidase P7-like和細(xì)胞色素基因P450的表達(dá)均在輕度弱光脅迫時顯著下調(diào)，在重度弱光脅迫時進(jìn)一步顯著下調(diào);而抗病蛋白基因RGA3在輕度弱光脅迫下的表達(dá)與CK無顯著差異（P>0.05），在重度弱光脅迫下顯著下調(diào)?？梢?，上述基因?qū)θ豕饷{迫表現(xiàn)特異性響應(yīng)，輕度脅迫或重度脅迫下表達(dá)受到不同程度的抑制，可能參與了煙草在弱光脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)。

3 討論

當(dāng)一定程度的逆境脅迫阻礙植物體合成蛋白時，植物會增加某些蛋白的含量來適應(yīng)環(huán)境。植物體內(nèi)可溶性蛋白和Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均會響應(yīng)環(huán)境脅迫，Pro是細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在脅迫環(huán)境下調(diào)節(jié)一系列代謝反應(yīng)（Zhang et al.，2015）。何靜雯等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，弱光脅迫下葡萄葉片的Pro含量與脅迫程度呈正相關(guān)，而可溶性蛋白含量先升高后下降，證明適度遮陰在一定程度上有利于葡萄生長，但重度脅迫造成的傷害不可逆，植物自身已無法通過適應(yīng)反應(yīng)進(jìn)行應(yīng)激調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明，苗期一定程度的弱光誘導(dǎo)可顯著上調(diào)煙苗葉片內(nèi)的Pro含量，但隨著弱光脅迫程度的加深，Pro含量開始大幅降低;而可溶性蛋白含量隨脅迫程度的加劇同步下降，與何靜雯等（2018）的結(jié)論不完全相同，可能是由于重度弱光脅迫嚴(yán)重破壞了煙苗內(nèi)部的生理平衡，使其無法積累更多的Pro來抵御不良環(huán)境的傷害。

脅迫條件下植物細(xì)胞膜脂過氧化加劇會導(dǎo)致MDA大量積累，使細(xì)胞受損，而抗氧化酶系統(tǒng)中CAT、POD和SOD等保護(hù)酶能清除活性氧和自由基，與植物抗逆密切相關(guān)（Sridevi and Chellamuthu，2015）。楊興有等（2008）研究表明，隨著光強(qiáng)的降低，成苗移栽后煙草葉片內(nèi)MDA含量逐漸升高，同時POD活性降低。倪國仕等（2014）研究表明，與全光照相比，一定程度的遮光能刺激煙草葉片成熟期POD和SOD活性提高。李正付等（2016）研究表明，煙草成苗移栽后，弱光脅迫可使其體內(nèi)MDA含量上升，旺長期MDA含量增加，導(dǎo)致膜脂過氧化，影響煙苗最終的生長發(fā)育及品質(zhì)形成。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著弱光脅迫加劇，煙苗葉片內(nèi)的超氧陰離子產(chǎn)生速率提高，MDA含量亦顯著升高，與楊興有等（2008）、李正付等（2016）的研究結(jié)果相似;同時苗期弱光刺激顯著提高了煙苗體內(nèi)的SOD、CAT和POD活性;但隨著弱光脅迫程度的加深，抗氧化酶活性開始大幅度下降，說明煙苗內(nèi)部的代謝被破壞，自我調(diào)節(jié)能力減弱，體內(nèi)的防御酶系統(tǒng)不足以抵抗由于脅迫而產(chǎn)生的自由基與活性氧，導(dǎo)致有害物質(zhì)在煙苗體內(nèi)積累過量，致使煙苗的生長發(fā)育受阻，與侯偉等（2015）對西瓜幼苗的研究一致。

作為植物的重要保護(hù)酶類，POD基因在植物的脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用（Ren et al.，2014）。目前研究表明，植物POD基因在同種或不同種脅迫下的表達(dá)并不一致。銀杏在干旱及ABA脅迫下其POD1基因表達(dá)下調(diào)，同時其表達(dá)被重金屬及一些傷害顯著誘導(dǎo)（程華等，2010）;而甘蔗POD2基因在干旱、ABA及鹽脅迫下其表達(dá)量上調(diào)（蘇亞春等，2017），同時其表達(dá)受H2O2誘導(dǎo);對白楊的研究顯示，其POD1基因在干旱脅迫下表達(dá)亦下調(diào)（Bae et al.，2006）;王海波等（2017）對小桐子的研究發(fā)現(xiàn)，其POD73基因被低溫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。煙草POD是一類具有功能多樣性的基因家族，目前已有相關(guān)克隆和表達(dá)分析。楊尚諭等（2018）對克隆得到的煙草POD1基因進(jìn)行多種脅迫條件下的表達(dá)模式分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NtPOD1基因的表達(dá)受鹽脅迫抑制，并受H2O2和低鉀脅迫的誘導(dǎo)上調(diào)。此外，有學(xué)者結(jié)合POD活性及其基因表達(dá)分析展開相關(guān)研究。黃瓜葉片的POD活性在脅迫14 d以前升高，而后下降，同時其POD基因在第14 d表達(dá)上調(diào)，而后下調(diào)（張之為等，2017）;同樣利用高溫處理，對兩個水稻品種的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其POD活性在脅迫第3 d前升高，而后下降，同時在脅迫第7 d，G725品種POD基因表達(dá)大幅下調(diào)，而II838品種POD基因表達(dá)上調(diào)（王艷等，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，煙苗葉片的POD活性隨光照強(qiáng)度的減弱而提高，但重度弱光脅迫時下降，同時peroxidase P7-like基因在輕度弱光脅迫時下調(diào)，在重度弱光脅迫時進(jìn)一步下調(diào)。由此可見，POD及其類似物基因在不同物種、不同脅迫條件下的表達(dá)存在差異。

GH3（Gretchen Hagen 3）基因是一類生長素早期響應(yīng)基因家族，目前已陸續(xù)在植物中克隆獲得（曾文芳等，2015）。研究表明，除在植物生長發(fā)育生理進(jìn)程中的作用外，大豆GH2/4還被H2O2、鹽及重金屬等脅迫信號誘導(dǎo)，參與某些脅迫的反應(yīng)過程。對擬南芥幼苗形態(tài)學(xué)的觀察發(fā)現(xiàn)，其子葉、真葉和根部的生長受氧化脅迫影響，而這種影響與GH3蛋白調(diào)控生長素的含量水平和機(jī)體內(nèi)的動態(tài)分配有直接關(guān)系（Pasternak et al.，2005）?；蛐酒Y(jié)果顯示，在所檢測的207個煙草腺毛優(yōu)勢表達(dá)基因中，P450基因與生物堿代謝及防御反應(yīng)等密切相關(guān)（Cui et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)，GH3.6和P450基因在輕度弱光脅迫時下調(diào)，在重度弱光脅迫時進(jìn)一步下調(diào)，證明其可能參與了煙草的光信號應(yīng)激反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)重度弱光脅迫使抗病基因同源物（RGA）表達(dá)大幅下調(diào)，暗示脅迫干擾光信號途徑生理反應(yīng)的同時，可能伴隨其他抗性因子的協(xié)同響應(yīng)。

4 結(jié)論

一定程度的弱光脅迫能激活煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)，抑制幼苗內(nèi)源物質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，推測其可能參與了煙草的光信號應(yīng)激反應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 王 暉）