明媚 羅文

[摘要]目的 探討視網膜母細胞瘤組織microRNA-215（miRNA-215）、視網膜母細胞瘤蛋白（Rb1蛋白）表達及其與臨床病理學特征的相關性。方法 選取視網膜母細胞瘤病人65例（73眼）手術切除的癌組織及其配對的癌旁正常組織，采用RT-PCR法檢測兩者miRNA-215表達、Western blot方法檢測兩者Rb1蛋白水平，并分析miRNA-215與Rb1蛋白相關性及二者與病人臨床病理特征的相關性及預后的關系;進行細胞轉染實驗，采用噻唑藍比色法（MTT）、Caspase-3活性檢測、流式細胞術分析miRNA-215類似物及miRNA-215抑制物對人視網膜母細胞瘤細胞（Y79細胞）活力、增殖及凋亡的影響。結果 視網膜母細胞瘤腫瘤組織中miRNA-215的表達水平顯著高于癌旁組織，Rb1蛋白表達水平顯著低于癌旁組織，差異有顯著性（t=-14.14、92.80，P<0.01）。分化型腫瘤組織中miRNA-215表達低于未分化型，Rb1蛋白表達高于未分化型;伴隨神經浸潤和淋巴結轉移病人腫瘤組織中miRNA-215表達高于未出現(xiàn)神經浸潤和淋巴結轉移病人，Rb1蛋白表達低于未出現(xiàn)神經浸潤和淋巴結轉移病人（t=-55.30～344.30，P<0.05）。細胞轉染結果顯示，miRNA-215類似物能顯著升高Y79細胞中miRNA-215的表達水平并導致細胞活力升高、增殖能力增強及凋亡細胞百分比降低，同時顯著降低細胞內Rb1蛋白表達水平;miRNA-215抑制物則顯著降低Y79細胞中miRNA-215的表達水平并導致細胞活力降低、增殖能力下降、胞內Caspase-3活性增加及凋亡細胞百分比增加，同時升高細胞內Rb1蛋白表達水平，差異有顯著性（F=148.5～3 938.0，P<0.01）。結論 視網膜母細胞瘤組織中miRNA-215和Rb1蛋白表達與臨床病理學特征相關，可作為視網膜母細胞瘤預后的監(jiān)測指標。

[關鍵詞]視網膜母細胞瘤;miRNA-215;視網膜母細胞瘤蛋白質;病理學，臨床

[中圖分類號]R739.72

[文獻標志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0586-05

doi：10.11712/jms201905020

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

視網膜母細胞瘤是一種較為常見的惡性腫瘤，多發(fā)生于視網膜核層，具有一定的家族傾向，常發(fā)生于5 歲以下的小兒，且容易發(fā)生顱內和遠處轉移，嚴重威脅病兒的生命健康[1-2]。探討視網膜母細胞瘤發(fā)病的分子機制并尋找早期診斷的生物學標志物和新的治療靶點，對于提高視網膜母細胞瘤的診治水平和改善病兒預后具有重要意義[3-4]。已有研究表明，視網膜母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展與基因突變、表觀遺傳修飾等多種分子機制有關，而視網膜母細胞瘤蛋白（Rb1蛋白）可能在這一過程中發(fā)揮著極其重要的作用[5-6]。Rb1是一種抑癌蛋白，在肺癌、胃癌、乳癌等多種癌癥中存在失活情況;而microRNA-215（miRNA-215）在多種腫瘤組織中均異常表達，其在腫瘤增殖、遷移及侵襲等多種病理過程中均發(fā)揮著重要功能[8-9]，但其能否抑制Rb1 蛋白的表達目前尚不明確。本研究探討視網膜母細胞瘤組織miRNA-215的表達特點及其與Rb1蛋白水平及臨床病理學特征的相關性，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年1月—2014年12月，選取在我院眼科行手術摘除眼球治療并經病理診斷為視網膜母細胞瘤病人65例（73眼），男25例，女40例;年齡5.0個月～8.5歲，平均（3.9±0.9）歲;分化型25眼，未分化型48眼;發(fā)生神經浸潤38眼，未發(fā)生神經浸潤35眼;出現(xiàn)淋巴結轉移29例，未出現(xiàn)淋巴結轉移36例。所有病兒術前均未接受化療及局部放療等治療。本研究獲得病人監(jiān)護人知情同意及醫(yī)院的倫理學審核通過。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 RT-PCR檢測miRNA-215表達 取病人手術切除的腫瘤組織及癌旁正常組織各50 mg，應用Trizol提取組織和細胞中總RNA，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄為DNA，在聚合酶的作用下進行擴增，引物及其序列見表1。

取擴增后的產物，利用熒光定量PCR儀（AB 7500cx）定量檢測miRNA-215水平。Trizol提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購自美國AB公司，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 Western blot檢測Rb1蛋白表達 取手術切除的腫瘤組織及癌旁正常組織各75 μg，以100 g/L十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，分離后轉移至孔徑為0.45 μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，置于50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h;加入一抗（1∶1 000稀釋的Rb1多克隆抗體）后4 ℃孵育過夜，以體積分數(shù)0.005的TBS-T溶液洗膜3次后再加入HRP標記的二抗（1∶10 000）進行反應，以體積分數(shù)0.005的TBS-T溶液洗膜3次，用化學發(fā)光法進行顯色，并應用圖像軟件進行灰度值分析，計算目標蛋白與β-actin的灰度比值。

1.2.3 miRNA-215蛋白檢測 培養(yǎng)視網膜母細胞瘤Y79細胞，穩(wěn)定傳代2～3代后，取對數(shù)生長期的細胞，將miRNA-215表達質粒（miRNA-215 mi-mics）、miRNA-215抑制質粒（miRNA-215 inhibitor）及其相應的miRNA-215對照質粒轉染視網膜母細胞瘤系細胞，用培養(yǎng)基制備單細胞懸液，轉染24、48、72 h后每孔加5 g/L的MTT溶液20 μL;孵育4 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加DMSO溶液150 μL，靜置15 min后以酶標儀檢測490 nm波長處各孔的吸光度值，以其表示miRNA-215蛋白值。

1.2.4 BrdU檢測 取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液接種于96孔板，轉染后培養(yǎng)24 h，加入20 μL BrdU標記液繼續(xù)培養(yǎng)6 h。先加入Fix Denat使DNA變性，再加入100 μL HRP標記的抗BrdU抗體，洗滌3次后加入100 μL的TMB底物液進行顯色，20 min后加1 mol/L H2SO4Y終止反應，在酶標儀上檢測吸光度值，此吸光度值即BrdU值[10]。

1.2.5 Caspase-3蛋白檢測 將轉染48 h后的細胞加2.5 g/L胰酶進行消化，1 000 r/min離心5 min后棄掉胰酶，以PBS洗滌細胞2次，再以2 000 r/min離心5 min后收集細胞沉淀;加入50 μL預冷的Lysis Buffer并置于冰上裂解20～30 min，隨后于4 ℃以10 000 r/min離心1 min。吸取上清液，應用BCA法測定Caspase-3蛋白濃度，檢測步驟嚴格按照Caspase-3活性檢測試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司）說明書進行操作。

1.2.6 細胞凋亡率檢測 取轉染48 h后的細胞，以PBS洗滌后1 000 r/min離心5 min，棄去上清，以Binding buffer重懸細胞并調整密度為1×109/L，用流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測[11]。上述每項實驗均重復12次。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 16.0和GraphPadPrism 5 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;計量資料以[AKx-D]±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征對miRNA-215及Rb1蛋白表達影響

視網膜母細胞瘤腫瘤組織miRNA-215表達顯著高于癌旁組織，Rb1蛋白表達顯著低于癌旁組織，差異有顯著性（t=14.14、92.80，P<0.01）。分化型腫瘤組織miRNA-215表達低于未分化型，而Rb1蛋白表達高于未分化型（t=-55.30、63.24，P<0.01）;有神經浸潤和淋巴結轉移病人腫瘤組織中miRNA-215表達高于無神經浸潤和淋巴結轉移者（t=-2.79、-76.18，P<0.01），Rb1蛋白表達低于未出現(xiàn)神經浸潤和淋巴結轉移者（t=344.30、80.56，P<0.01）。見表1。

2.2 miRNA-215類似物和抑制物對視網膜母細胞瘤Y79細胞各指標的影響

miRNA-215類似物顯著上調miRNA-215表達水平，增強細胞增殖能力，降低細胞內Caspase-3活性，減少Y79細胞凋亡百分比;miRNA-215抑制物顯著降低miRNA-215表達水平，減弱細胞增殖能力，提高細胞內Caspase-3活性，增加細胞凋亡百分比，差異均有統(tǒng)計學意義（F=148.5～3 938.0，P<0.01）。見表2。

3 討論

視網膜母細胞瘤是一種來源于光感受器前體細胞的惡性腫瘤，也是嬰幼兒眼病中性質最嚴重、危害性最大的一種惡性腫瘤[12-13]。視網膜母細胞瘤常見于3歲以下兒童，具有家族遺傳傾向，可單眼、雙眼先后或同時罹患，易發(fā)生顱內及遠處轉移，常常危及病兒生命[14-16]。視網膜母細胞瘤的臨床表現(xiàn)復雜，可表現(xiàn)為結膜內充血水腫、角膜水腫、虹膜新生血管、玻璃體混濁、眼壓升高及斜視等[17-18]。視網膜母細胞瘤的確切病因和具體發(fā)病機制目前尚不完全清楚，一般認為與遺傳和病毒感染等因素有關，而位于13q14抑癌基因Rb1突變、失活可能是導致視網膜母細胞瘤發(fā)生的主要機制[19]。視網膜母細胞瘤的危害較為嚴重，如何早期診斷及治療是提高治療效果、降低死亡率的關鍵[20]。MicroRNA（miRNA）是一類重要的內源性單鏈非編碼小RNA分子，可調控細胞的發(fā)育、增殖、分化、代謝、凋亡和應激等過程[21-22]。越來越多的研究表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程有著密切的關系，其中miRNA-215在多種腫瘤組織中均發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用[23]。也有研究表明，miRNA-215在胃癌組織中高表達，并與腫瘤細胞的侵襲和轉移能力明顯相關[24]，但目前對于miRNA-215與視網膜母細胞瘤發(fā)生和發(fā)展關系的研究卻較少。

研究表明，miRNAs表達或功能異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關系[25-26]。Rb1蛋白是一種腫瘤抑制蛋白，也是細胞周期調控蛋白，可以通過抑制細胞周期進程防止細胞過度生長直至其具備分裂條件，其與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關系[27]。本文研究顯示，miRNA-215在視網膜母細胞瘤組織中的表達顯著高于癌旁組織，而Rb1蛋白的表達水平顯著低于癌旁組織，且分化型組織miRNA-215表達高于未分化型，Rb1蛋白表達則低于未分化型，提示miRNA-215、Rb1在視網膜母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起癌基因作用，且miRNA-215相對表達量越高，Rb1蛋白相對表達量越低，腫瘤的分化程度越高。進一步分析顯示，有神經浸潤和淋巴結轉移的視網膜母細胞瘤病人腫瘤組織中miRNA-215蛋白表達高于未出現(xiàn)神經浸潤和淋巴結轉移者，而Rb1蛋白低于未出現(xiàn)神經浸潤和淋巴結轉移者，提示miRNA-215、Rb1蛋白有可能成為視網膜母細胞瘤預后的監(jiān)測指標。

腫瘤細胞的活力和增殖能力增強以及凋亡的減弱是其重要的生物學特征，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物學基礎[28-29]。本文結果顯示，上調miRNA-215蛋白表達水平后細胞的增殖能力明顯增強，而Y79細胞內Caspase-3表達降低，凋亡細胞明顯減少;而下調miRNA-215表達水平可明顯減弱細胞增殖能力，提高細胞內Caspase-3活性，增加細胞凋亡百分比，提示miRNA-215的表達與視網膜母細胞瘤細胞的增殖能力、細胞活性以及凋亡有著密切的關系，其高表達可通過促進腫瘤細胞增殖、增強細胞活性、減少細胞凋亡，促進視網膜母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展[30-31]。

本文研究結果還表明，miRNA-215抑制物能顯著提高Y79細胞內Rb1蛋白的表達，而miRNA-215類似物能顯著降低Y79細胞內Rb1蛋白的表達，提示miRNA-215高表達可以顯著抑制Y79細胞內Rb1蛋白的表達，而下調miRNA-215表達可以顯著提高Y79細胞內Rb1蛋白的表達，這可能是miRNA-215參與視網膜母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展過程的主要機制，但其具體作用機制仍需做進一步的深入研究。

綜上所述，miRNA-215在視網膜母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因作用，其通過調控Rb1蛋白的表達影響視網膜母細胞瘤的發(fā)生以及發(fā)展，miRNA-215有可能成為視網膜母細胞瘤預后的監(jiān)測指標。

[參考文獻]

[1]趙馨，徐一力，吳亞，等. 圍妊娠期小鼠胰島細胞視網膜母細胞瘤蛋白的表達及其與β細胞擴增的關系[J]. 中華糖尿病雜志， 2018，10（9）：617-623.

[2]韓效林，李敬東，王婉玲，等. 骨髓增生異常綜合征患者外周血單個核細胞中視網膜母細胞瘤蛋白結合鋅指結構基因1的表達[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報， 2017，34（3）：166-169.

[3]劉朝，唐耀冰，楊延芳. miR-130b通過調控PTEN在人視網膜母細胞瘤發(fā)揮促癌作用[J]. 眼科， 2017，26（4）：276-281.

[4]陸燁，童劍萍. 視網膜母細胞瘤的發(fā)生機制及診斷和治療進展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學， 2016，24（6）：1007-1014.

[5]秦靜，段大鵬，車選義，等. 視網膜母細胞瘤中SHH與PTCH的表達及其意義[J]. 中華實用診斷與治療雜志， 2015，29（6）：559-561.

[6]鄭蔓茵，吳海輝，王軍，等. 視網膜母細胞瘤發(fā)病機制的研究進展[J]. 解剖學研究， 2015，37（3）：223-228.

[7]楊林聲，王理論，杜青衛(wèi). microRNA-215對人視網膜母細胞瘤細胞生長及抑癌基因Rb1表達的調控作用[J]. 海南醫(yī)學， 2015，26（24）：3592-3597.

[8]ABRAMSON D H， ELLSWORTH R M， ZIMMERMAN L E. Nonocular cancer in retinoblastoma survivors[J]. Transactions Section on Ophthalmology. American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology， 2015，81（3 Pt 1）：454-457.

[9]BENAVENTE C A， DYER M A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma[J]. Annual Review of Pathology， 2015，10（1）：547-562.

[10]黃東生，錢冰濤. 視網膜母細胞瘤基因及其遺傳性研究[J]. 中國小兒血液與腫瘤雜志， 2015，20（3）：114-117.

[11]趙敬聰，王建倉，蘇鳴，等. 兒童視網膜母細胞瘤臨床分析[J]. 河北醫(yī)藥， 2015，37（8）：1183-1185.

[12]王一卓，黃東生，史季桐，等. 侵犯視神經的視網膜母細胞瘤患兒465例預后分析[J]. 中華兒科雜志， 2015，53（2）：109-113.

[13]HANAHAN D， WEINBERG R A. Hallmarks of cancer： the next generation[J]. Cell， 2011，144（5）：646-674.

[14]CHO W C. MicroRNAs： potential biomarkers for cancer diagnosis， prognosis and targets for therapy[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology， 2010，42（8）：1273-1281.

[15]刁卓，劉曉超，唐玉虎，等. 胃癌組織miR-215表達變化及其與患者預后的關系[J]. 山東醫(yī)藥， 2017，57（8）：80-82.

[16]李勇，徐衛(wèi)星，徐軍，等. miR-101表達上調對視網膜母細胞瘤細胞的增殖及侵襲能力的抑制作用[J]. 眼科新進展， 2018，38（6）：527-532.

[17]田冰玉，白淑瑋，康前雁. microRNA-125b對人視網膜母細胞瘤增殖和凋亡作用實驗研究[J]. 陜西醫(yī)學雜志， 2017，46（11）：1491-1493.

[18]YOUSEF Y A， TBAKHI A， AL-HUSSAINI M A， et al. Mutational analysis of the Rb1 gene and the inheritance patterns of retinoblastoma in Jordan[J]. Familial Cancer， 2018，17（2）：261-268.

[19]JHA A， KHAN Y， REBHOLZ S D， et al. Abstract a27： a linked data approach to discover HPV oncoprotiens and RB1 induced mutation associations for the retinoblastoma research[J]. Cancer Research， 2017，77（2 Supplement）：A27-A27.

[20]胡輔華，劉麗林，季建，等. 卡鉑聯(lián)合MicroRNA-34a抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖和腫瘤生長的作用研究[J]. 眼科新進展， 2015，35（6）：528-531.

[21]梁建宏. 視網膜母細胞瘤治療中需要考慮的要點[J]. 中華眼底病雜志， 2018，34（3）：208-211.

[22]鄒鈞，江福能，韓兆冬，等. 視網膜母細胞瘤結合蛋白4在前列腺癌診斷中的價值[J]. 中華泌尿外科雜志， 2016，37（9）：703-706.

[23]GUI Fu， HONG Zhengdong， YOU Zhipeng， et al. MiR-21 inhibitor suppressed the progression of retinoblastoma via the modulation of PTEN/PI3K/AKT pathway[J]. Cell Biology International， 2016，40（12）：1294-1302.

[24]包小敏，陳華嬌，李兵. 視網膜母細胞瘤蛋白基因在喉癌研究中的進展[J]. 國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2016，40（1）：11-14.

[25]WANG Lilun， HU ?Haifeng， FENG Yanqin. Suppressive effect of microRNA-143 in retinoblastoma[J]. International Journal of Ophthalmology， 2016，9（11）：1584-1590.

[26]楊林聲，王理論，杜青衛(wèi)，等. microRNA-106b在視網膜母細胞瘤組織中表達的臨床意義及其生物學功能研究[J]. 蚌埠醫(yī)學院學報， 2017，42（10）：1333-1336.

[27]SHAH P K， SRIPRIYA S， NAREND RAN V， et al. Prenatal genetic diagnosis of retinoblastoma and report of RB1 gene mutation from India[J]. Ophthalmic Genetics， 2016，37（4）：430-433.

[28]柴松，薛冰，王歡，等. MicroRNA-98對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖和轉移的影響[J]. 實用醫(yī)學雜志， 2015，31（24）：4010-4011.

[29]GROTTA S， D’ELIA G， SCAVELLI R， et al. Advantages of a next generation sequencing targeted approach for the molecular diagnosis of retinoblastoma[J]. BMC Cancer， 2015，15（1）：1-9.

[30]ZHAO Yuehua， ZHANG Shilian， ZHANG Yongfeng. MicroRNA-320 inhibits cell proliferation， migration and invasion in retinoblastoma by targeting specificity protein 1[J]. Molecular Medicine Reports， 2017，16（2）：2191-2198.

[31]閆義濤，王曉麗，谷圓圓，等. 長鏈非編碼RNA MALAT1靶向miR-570-3p對人視網膜母細胞瘤細胞系SO-Rb50增殖、凋亡和侵襲的調控作用[J]. 中國免疫學雜志， 2018，34（11）：1621-1625.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）