秦云蕊 蔣珍藕 賴茂祥 黃云峰 王信宏

摘 要：該研究選取廣西不同類型的兩面針為材料，通過查閱文獻對兩面針基原植物進行考證，用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）對兩面針原變種及變種中的5種活性成分進行定量分析。結(jié)果表明：（1）毛兩面針＼[Zanthoxylum nitidum? （Roxb）dC. f. fastuosumHow ex Huang＼]早已并入兩面針原變種＼[Z. nitidum （Roxb.）dC. var. nitidum＼];雖然毛兩面針與毛葉兩面針中文名稱相似，但不可認為是同一個變種。（2）RP-HPLC結(jié)果顯示兩面針原變種及變種均不含毛兩面針素。（3）5種活性成分在不同類型中存在顯著性差異。（4）根據(jù)5種活性成分含量數(shù)據(jù)，對9份兩面針樣品進行聚類分析，結(jié)果劃分為4組，與兩面針形態(tài)劃分一致。這不僅理清了“毛葉兩面針”與“毛兩面針”存在的混淆問題，而且還比較了不同形態(tài)類型間的活性成分含量，為兩面針質(zhì)量控制和資源的合理應(yīng)用開發(fā)提供了參考。

關(guān)鍵詞：兩面針， 基原考證， 活性成分， 毛兩面針素

中圖分類號：Q946

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）04-0531-09

Abstract：In this study，different phenotypic types of Zanthoxylum nitidum from Guangxi were selected to illustrate the original scientific name of Zanthoxyli Radix through literature review and conduct the quantitative analyses of five effective components based on RP-HPLC. The results were as follows：（1） Zanthoxylum nitidum f. fastuosum that shared the similar Chinese name with Z. nitidum var. tomentosum but wasdistinctlydifferent between each other had already been incorporated into Z. nitidum var. nitidum; （2） Toddaloactone was not included in both Z. nitidum var. nitidum and Z. nitidum var. tomentosum; （3） The content of effective components indifferent types was significantlydistinct; （4） Clustering analysis based on the content of five effective components separated all populations into four groups， corresponding to phenotypicdelimitation. Totally， this study not only clarified the confusion between the Z. nitidum var. tomentosum and Z. nitidum var. nitidum Type 3， but also illustrated the significantdifference of effective components in four phenotypes. All results provide guidance for quality control and the rational application anddevelopment of resources in Z. nitidum.

Key words：Zanthoxylum nitidum， original scientific name， effective components， toddaloactone

兩面針是我國常用中藥，具有活血化瘀，行氣止痛，祛風通絡(luò)，解毒消腫的功效?！端幍洹分幸?guī)定兩面針藥材的基原為蕓香科花椒屬植物兩面針（Zanthoxylum nitidum）（中國藥典，2015）?！吨袊参镏尽返?3卷第2冊（1997）將兩面針分為原變種及變種毛葉兩面針，原變種下又分為3個類型。兩面針主要開發(fā)生產(chǎn)為藥品和日用品，年需求量大，其苯駢菲啶類生物堿及木脂素具有解痙鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗癌等活性（文屏等，2018;賈微等，2016;馬春玉，2007;張守堯等，2002）。因兩面針類型3（毛兩面針）與變種毛葉兩面針中文名相似，且兩者嫩枝、花序軸及花梗均被短柔毛，所以在基原植物鑒定上易將兩者混淆，一些文獻資料和各地方植物志對兩面針類型3和變種在物種的鑒定命名上也存在多種寫法，這就給兩面針藥材的臨床用藥及研究帶來許多困擾。因此本研究對兩面針的基原植物進行考證，重申毛兩面針拉丁名的正確寫法。

本研究通過文獻查閱及形態(tài)學比較的方法對兩面針不同類型及變種進行了對比與考證，用高效液相色譜法考證了毛兩面針素與毛兩面針的關(guān)系，同時測定兩面針原變種下3個類型及變種中氯化兩面針堿等5種成分含量上的差異，為兩面針在抗腫瘤藥物和鎮(zhèn)痛等方面的資源開發(fā)利用及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。所有實驗樣品均經(jīng)過廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員與黃云峰副研究員鑒定，憑證標本存放于廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院標本館（GXMI）。樣品的具體采集地點以及鑒定信息見表1。

1 材料與方法

1.1 材料

所有樣品均為廣西產(chǎn)，兩面針3個類型及變種取自8個產(chǎn)地，詳見表1。每批次藥材共設(shè)置3個重復(fù)，藥材經(jīng)過60 ℃烘干，粉碎，過3號篩備用。

1.2 儀器與試劑

儀器：安捷倫1260高效液相色譜儀、AgilentdAD檢測器及 Agilent Chemistation 色譜工作站;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）;FA1004 型電子分析天平（上海精科電子天平）; GZX-GF101-4-BS-Ⅱ 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）。

試劑：氯化兩面針堿對照品（質(zhì)量分數(shù)為91%，批號為110848-200603）;白屈菜紅堿對照品（質(zhì)量分數(shù)為80.5%，批號為111718-201402）;毛兩面針素（批號為111531-201603）;乙氧基白屈菜紅堿（批號為110847-200601）購自中國食品藥品檢定研究院;鹽酸血根堿（批號為wkq17052202）;別隱品堿（批號為wkq17020602）;L-芝麻脂素（批號為wkq16080503）;L-細辛脂素（批號為wkq16071301）純度均 ≥98%，購自四川省維克奇生物科技有限公司。對照品中除毛兩面針素與乙氧基白屈菜紅堿分別供鑒定檢查用之外，其他均可用于含量測定;乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）;水為超純水，甲醇、磷酸、三乙胺均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1基原植物考證 通過查看各植物標本館中兩面針各類模式標本和普通標本，以及查閱兩面針相關(guān)文獻，掌握兩面針在植物分類學中的修訂歷史并找出各拉丁名最初的源頭。在實地調(diào)查過程中除認真觀察兩面針變種、類型之間葉片質(zhì)地和植株的被毛情況外，還比較了兩面針變種、類型之間莖部皮刺是否存在區(qū)別。

1.3.2 RP-HPLC法含量測定

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3 C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：乙腈 （A）-水溶液 （B，含0.25%三乙胺+0.2%磷酸）。梯度洗脫：0～6 min，25% A;6～25 min，25%～32% A;25～29 min，32%～60% A;29～45 min，60% A。流速：1.0 mL·min-1。檢測波長：273 nm （氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、乙氧基白屈菜紅堿、鹽酸血根堿）、 284 nm （別隱品堿、L-芝麻脂素、L-細辛脂素）、328 nm （毛兩面針素）。柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。

1.3.2.2 溶液的制備 混合對照品的制備：精密稱取各對照品，用甲醇溶解定容，制成氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、乙氧基白屈菜紅堿、毛兩面針素、鹽酸血根堿、別隱品堿、L-芝麻脂素、L-細辛脂素的質(zhì)量濃度分別為0.327 6、0.107 87、0.20、0.18、0.412、0.90、0.83、0.79 mg·g-1的單一對照品儲備液，移取適量單一對照品儲備液，置同一容量瓶中，制成5個濃度梯度的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：取過三號篩樣品粉末0.5 g，精密稱量，置具塞錐形瓶中，用70%甲醇20 mL超聲處理30 min，冷至室溫，濾過，濾液置50 mL容量瓶中，濾渣和濾紙再同法處理一次，濾液置于同一容量瓶中，加少量70%甲醇洗滌多次，洗液并入同一容量瓶中，用70%甲醇定容，搖勻，微孔濾膜濾過（0.45 μm），取續(xù)濾液。

1.3.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取“1.3.2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“1.3.2.1”項下色譜條件采集色譜圖（圖1），各待測成分色譜峰的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)>5 000，說明各成分基線分離良好。

1.3.2.4 線性關(guān)系考察 移取“1.3.2.2”項下對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。以“1.3.2.1”項下色譜條件逐一進樣測定，以待測成分進樣量（X，μg）為橫坐標，色譜峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到各成分的回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表2。

1.3.2.5 精密度試驗 取“1.3.2.2”項下混合對照品溶液，按“1.3.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積，得氯化兩面針堿、鹽酸血根堿、別隱品堿、L-芝麻脂素、L-細辛脂素峰面積的RSD分別為0.53%、0.33%、0.48%、3.02%、0.44% （n=6），表明儀器的精密度良好。

1.3.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“1.3.2.2”項下供試品溶液，分別在室溫下放置0、4、8、12、24、48 h、按“1.3.2.1”項下色譜條件檢測，記錄峰面積。計算氯化兩面針堿、鹽酸血根堿、別隱品堿、L-芝麻脂素、L-細辛脂素峰面積的RSD （n=6）分別為0.08%、0.48%、1.11%、1.89%、2.84%，說明供試品溶液中5個待測成分在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.3.2.7 重復(fù)性試驗 稱取同一樣品0.5 g，按“1.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，并按以上色譜條件分析，將峰面積代入標準曲線回歸方程，計算氯化兩面針堿、鹽酸血根堿、別隱品堿、L-芝麻脂素、L-細辛脂素峰含量的RSD分別為0.46%、1.75%、1.12%、1.87%、1.83%，表明方法的重復(fù)性良好。

1.3.2.8 加樣回收率試驗 取已知待測成分含量的樣品0.25 g，共9份，加入低、中、高含量的待測成分對照品各3份，按“1.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“1.3.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，氯化兩面針堿等5種成分的平均回收率分別為1.51%、1.95%、1.57%、3.23%、2.35%。

1.3.2.9 樣品含量測定 分別精密稱取9個樣品粉末，樣品溶液制備按“1.3.2.2”項下方法，再用“1.3.2.1”項下色譜條件測定，將峰面積代入標準曲線回歸方程計算各樣品中5種成分的含量，結(jié)果見表4。

1.3.2.10 數(shù)據(jù)分析 采用origin和 SPSS19.0數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩面針基原植物考證

《中國植物志》第43卷第2冊（1997）記載兩面針包括一個原變種和一個變種，原變種又根據(jù)小葉形態(tài)及被毛情況分為3個類型，即類型1、類型2、類型3，類型1與Roxburgh首先發(fā)表的模式標本一致，該模式標本原植株采集地在廣州市郊，1812年被引種至印度加爾各答植物園，次年自該植株采下標本并發(fā)表。根據(jù)作者多年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，類型1因其莖上的栓皮刺呈灰白色，民間常稱為“白皮兩面針”;類型2因長在石山上被稱為“石山類型”;類型3因葉腹面皮刺常不發(fā)育，而葉背皮刺存留，同時嫩莖被短柔毛，所以廣西民間會把類型3稱為 “單面針”或“毛兩面針”。余麗瑩等對廣西兩面針野生種質(zhì)資源進行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)兩面針3個類型和變種在廣西都有分布（余麗瑩等，2009a，b），而變種毛葉兩面針（Zanthoxylum nitidum var. tomentosum）僅分布于廣西平南與金秀大瑤山地區(qū)，其模式標本就采自于廣西平南，是當?shù)噩庒t(yī)的習用藥材，現(xiàn)已被《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標準》（2014）收載。兩面針原變種下各類型和變種之間在形態(tài)上的主要區(qū)別在于葉片質(zhì)地和植株的被毛情況，但通過作者的實地調(diào)查和前期研究發(fā)現(xiàn)兩面針除了葉片質(zhì)地和植株的被毛情況有明顯區(qū)別外，各類型莖干上的皮刺也有明顯差異（圖2）。

類型1的莖上有翼狀蜿蜒而上的木栓層刺，類型2老莖基本無刺、或被非常稀疏的小刺，類型3（毛兩面針）具柱狀刺，變種毛葉兩面針的莖小，只分布有稀疏的小刺。據(jù)根葉片質(zhì)地、被毛情況及莖上皮刺的形態(tài)特征，易鑒別出所采樣品為何種類型。通過查閱相關(guān)文獻和兩面針臘葉標本，作者發(fā)現(xiàn)在兩面針原植物鑒定過程中常存在以下錯誤，第一是將兩面針原變種下的類型3（毛兩面針）鑒定為毛葉兩面針（Zanthoxylum nitidum var. tomentosum），1956年侯寬昭將采自廣州白云山的兩面針標本定為一新變種，即疏刺兩面針（Z. nitidum var. negelect），1974年侯寬昭和黃成就又將采自海南的兩面針標本發(fā)表為兩面針的新變型—疏刺花椒（Z. nitidum f. fastuosum），1987年黃成就將兩者歸并為兩面針（Z. nitidum），同時把廣西平南縣大瑤山山脈采集到葉背面密被柔毛的兩面針標本，定為兩面針的新變種，即毛葉兩面針（Zanthoxylum nitidum var. tomentosum）。通過查閱疏刺兩面針和疏刺花椒的模式標本及野外實地調(diào)查，我們認為這兩者實際上就是兩面針原變種的類型3，即常說的“毛兩面針”，因人們常說的“毛兩面針”和“毛葉兩面針”兩者之間只有一字之差，而且兩者對應(yīng)的原植物也都有毛，因此非常容易造成鑒定錯誤。第二是將兩面針類型3 （毛兩面針）的拉丁名寫錯為Z. nitidum var. fastuosum，通過溯源我們發(fā)現(xiàn)這一拉丁名最早源于《廣東植物志》第2卷（1991），此拉丁名在The International Plant Names Index （IPNI）上進行查詢，但并不存在，很可能是編寫者把兩面針的變型“f.”錯誤的寫成變種“var.”的緣故，《廣西中藥材標準》第2冊（1996）在制定兩面針標準時，因引用了《廣東植物志》這一文獻，所以也使用了錯誤的拉丁名。

2.2 RP-HPLC檢測兩面針中毛兩面針素

采用328 nm波長下的液相色譜圖建立指紋圖譜，查看9批樣品及兩面針混偽品飛龍掌血中與對照品處是否有共有峰，如圖3所示，僅飛龍掌血在b處與毛兩面針素有共有峰，兩面針下3個類型及變種在b處則無共有峰。說明兩面針原變種下3個類型和變種毛葉兩面針中均不含有毛兩面針素。

2.3 不同類型兩面針含量分析

不同類型的兩面針及毛葉兩面針內(nèi)5種化合物含量表現(xiàn)出不同的規(guī)律。如圖4所示，類型3和毛葉兩面針中氯化兩面針堿含量最高，類型1的氯化兩面針堿含量最低。鹽酸血根堿的含量在兩面針三個類型及變種中差異不顯著。別隱品堿的含量，毛葉兩面針中含量最高，類型2和類型3次之，類型1最低。類型1的L-芝麻脂素、L-細辛脂素含量最高。

2.4 聚類分析

兩面針中氯化兩面針堿、鹽酸血根堿、別隱品堿、L-芝麻脂素、L-細辛脂素的含量范圍分別在0.70～4.33、0.31～2.51、0.47～21.17、0.15～2.39、0～1.12 mg·g-1之間。氯化兩面針堿含量以天峨的類型3最高，其次為金秀的變種毛葉兩面針，防城的最低;鹽酸血根堿在那坡的樣品中含量最高，最低的在欽州;別隱品堿的含量以金秀的樣品最高，桂平的最低;L-芝麻脂素、L-細辛脂素的含量均以桂平的樣品最高，L-細辛脂素在那坡、欽州、金秀的樣品中含量均為0，L-芝麻脂素則以那坡的含量為最低，見表3。

以氯化兩面針堿等5種成分的總含量做聚類分析，聚類結(jié)果與兩面針類型基本一致。金秀的變種聚為一類，桂平與防城的類型1聚為一類，天峨與那坡類型2聚一類，余下天峨、欽州、來賓、大新的類型3聚為另一類。

3 討論與結(jié)論

3.1 兩面針基原植物考證

因受生境、生長階段等因素的影響，植物的表型會出現(xiàn)一些明顯的差異，這就給植物分類學家?guī)砀蓴_。同時因毛兩面針與毛葉兩面針中文名相似，所以對一些沒有植物分類學研究的科研人員來說，易將兩者混淆。該文通過調(diào)查和查閱文獻對兩面針基原植物進行考證，查出毛兩面針在植物分類學中曾以疏刺兩面針（Zanthoxylum. nitidum var. negelect）及疏刺花椒（Z. nitidum f. fastuosum）命名，不存在拉丁名為Z. nitidum var. fastuosum的毛兩面針。同時指正民間常說的毛兩面針為原變種下的一個類型，與毛葉兩面針有別，對后續(xù)的研究者不再將兩者混淆，不再使用錯誤的拉丁名具有積極意義。黃琪等（2012）在毛兩面針中檢測到毛兩面針素，有可能是購買的實驗樣品是兩面針混偽品飛龍掌血的原因，也可能是受到《中國藥典》兩面針項下的“毛兩面針”檢查項即檢查毛兩面針素來判斷兩面針與毛兩面針的誤導。本研究通過RP-HPLC指紋圖譜的研究發(fā)現(xiàn)毛兩面針素在兩面針混偽品飛龍掌血中，而在兩面針原變種和毛葉兩面針中均未發(fā)現(xiàn)。這與秦澤慧等（2011）、胡亮等（2017）的研究結(jié)果一致。

3.2 兩面針含量測定

化學成分是中藥材療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，定量和定性的化學成分分析是中藥材質(zhì)量評價體系的重要組成成分。本研究選取了兩面針中5種重要的苯駢菲啶類生物堿及木脂素化合物（氯化兩面針堿、鹽酸血根堿、別隱品堿、L-芝麻脂素、L-細辛脂素），用RP-HPLC定量分析了不同類型兩面針內(nèi)5種成分含量的差異，可為兩面針質(zhì)量控制和資源的合理應(yīng)用開發(fā)提供重要的信息，對于指導兩面針野生轉(zhuǎn)家種工作具有重要意義。

通過比較兩面針5種活性成分含量，其中活性成分氯化兩面針堿是《中國藥典》2015版規(guī)定的檢測成分，要求氯化兩面針堿的含量不低于1.3 mg·g-1，9個樣品中除采自于防城的類型1為0.7 mg·g-1低于藥典規(guī)定外，其余樣品氯化兩面針堿含量均高于藥典規(guī)定，毛葉兩面針中氯化兩面針堿的含量僅次于含量的最高類型3，其別隱品堿的含量為最高，是天峨類型2的1.6倍，可見毛葉兩面針中生物堿的含量并不低。

本研究發(fā)現(xiàn)兩面針中的白屈菜紅堿與乙氧基白屈菜堿的色譜峰重疊，改變色譜條件，也無法將兩者分離，可能是白屈菜紅堿與乙氧基白屈菜紅堿在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別僅在于一個乙氧基，所以要在色譜柱中將兩者分離，存在很大的難度。通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)不存在同時測定兩面針中乙氧基白屈菜紅堿與白屈菜紅堿的文章，而都是選測兩者中的一種（孫科等，2017;方琳喬等，2011;梁廣華和張建浩，2005），這可能是前人未能及時發(fā)現(xiàn)此問題的關(guān)鍵所在。

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