針刺大椎、百會、人中穴對大鼠腦缺血再灌注 損傷后ES蛋白表達的影響

武姿含　蔣素容　陳芯儀　高音來　肖山峰　田浩梅　陳楚淘

〔摘要〕 目的 探討針刺大椎、百會、人中穴對內皮抑素（Endostatin， ES）作用于大鼠腦缺血再灌注損傷后的表達變化及影響，研究ES作用于腦保護的部分機制。方法 將50只SD大鼠隨機分為正常組、假手術組各10只，其余30只大鼠參照ZeaLonga線拴法制作大腦中動脈缺血模型，造模成功后再隨機分為模型組、依達拉奉組、針刺組，10只/組。正常組、假手術組、模型組僅捆綁，依達拉奉組以3 mg/kg（稀釋至1 mL）腹腔注射，針刺組行大椎、人中、百會穴針刺，每12 h行1次治療，6次后行神經功能缺損評分，再行Western Blot法檢測ES表達。結果 （1）神經功能缺損評分對比：治療后，與正常組、假手術組比較，其余3組評分較高（P<0.01）;與模型組比較，依達拉奉組及針刺組評分下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;治療前后依達拉奉組及針刺組組內比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。（2）ES比較：治療后與正常組及假手術組比較，其余3組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，依達拉奉組及針刺組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論 大鼠腦缺血再灌注損傷后，針刺能使神經功能缺損評分下降，并能在一定程度上減少缺血區(qū)域海馬組織ES的表達，達到減輕腦缺血再灌注損傷的作用機制，促進腦組織的修復。

〔關鍵詞〕 腦缺血再灌注;針刺;大椎穴;百會穴;人中穴;內皮抑素

〔中圖分類號〕R245? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.015

Effects of Acupuncture Dazhui （DU14）， Baihui （GV20）， Renzhong （GV26） on ES

Protein Expression after Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats

WU Zihan， JIANG Surong， CHEN Xinyi， GAO Yinlai， XIAO Shanfeng， TIAN Haomei， CHEN Chutao*

（College of Acupuncture， Moxbustion and Massage， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the changes and effects of acupuncture Dazhui （DU14）， Baihui （GV20）， Renzhong （GV26） on the expression of Endostatin （ES） after cerebral ischemia reperfusion injury in rats and the mechanism of ES on brain protection. Methods A total of 50 SD rats were randomly divided into the normal group and the sham operation group， with 10 rats in each group. The other 30 rats were used to establish cerebral ischemia model according to the ZeaLonga method. After successful modeling， they were divided into the model group， the edaravone group， and the acupuncture group， with 10 rats in each group. The normal group， the sham operation group and the model group were only bundled. The edaravone group was injected with 3mg/kg （diluted to 1 mL） by intraperitoneal injection. In the acupuncture group， acupuncture at Dazhui （DU14）， Baihui （GV20）， Renzhong （GV26） was performed for 1 time in every 12 h， and neurological function defect score was performed after 6 times， and then the expression of ES was detected by Western Blot. Results （1） Comparison of neurological defects scores between groups： After treatment， compared with the normal group， and the sham operation group， the scores of other 3 groups were higher. Compared with the model group， the scores of the edaravone group and the acupuncture group decreased. The differences were statistically significant （P<0.01）. Comparing among the groups before and after the treatment， the differences were statistically significant （P<0.01）. （2） Comparison of ES： After treatment， compared with the normal group and the sham operation group， the differences among the other 3 groups were statistically significant （P<0.01）. Compared with the model group， the difference between the edaravone group and the acupuncture group was statistically significant （P<0.05）. Conclusion After cerebral ischemia reperfusion injury in rats， acupuncture can reduce the score of nerve function defect and reduce the expression of ES in the hippocampus tissue in the ischemia area to a certain extent， so as to reduce the mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury and promote the repair of brain tissue.

〔Keywords〕 cerebral ischemia reperfusion; acupuncture; Dazhui （DU14）; Baihui （GV20）; Renzhong （GV26）; endothelial inhibition

缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）又名腦梗死，本病多由腦動脈血管嚴重的狹窄、痙攣或完全阻塞導致。發(fā)生缺血性腦卒中后，在一定時間內，腦梗死區(qū)域獲得再次的血液灌流時，組織損傷非但沒有減輕或恢復反而進行性加重，這種現(xiàn)象為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI）[1]。大腦中動脈栓塞后，缺血半暗區(qū)神經生長抑制因子表達明顯上升，如內皮抑素（endostatin， ES）。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：穴位組ES蛋白磷酸化顯著下調至4%[2-5]，同時文獻顯示：ES是一種內源性血管生成抑制劑[6]，是最有效的血管生成抑制因子之一，可抑制內皮細胞的遷移和生長，且能在bFGF刺激血管內皮細胞增殖過程中，誘導內皮細胞凋亡，抑制血管新生的各個環(huán)節(jié)[7]。ES能下調促血管形成基因的表達，上調抗血管形成基因的表達，雙向調節(jié)病理性血管發(fā)生。故本實驗觀察針刺大椎、百會、人中（穴）72 h后鼠腦梗死區(qū)域海馬組織中蛋白的表達情況，從ES表達程度分析探討針刺對腦組織缺血損傷部分作用機制。

1 資料與方法

1.1? 動物及分組

SD大鼠50只，SPF級，雄性，體質量200～250 g，湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002]。20 ℃環(huán)境下，常規(guī)進食、飲水3 d并保持12 h的晝/夜循環(huán)之后，隨機分為正常組10只、假手術組10只，剩余30只造模成功后再隨機分成模型組、依達拉奉組、針刺組，10只/組。

1.2? 動物模型建立及納入試驗標準

需造模30只大鼠參照 Zea Longa方法[8]并加以改良制成局灶性腦缺血再灌注損傷模型。大鼠禁食、常規(guī)飲水24 h后，用10%的水合氯醛按0.3 mL/100 g劑量腹腔注射，仰臥位在右側距前正中線0.3 cm處，切1 cm小口，用止血鉗行鈍性剝離皮下筋膜，暴露頸總動脈（CCA）及分支頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA），分離以上動脈及迷走神經并掛線，于近心端結扎CCA與ECA，動脈夾夾住ICA，在距CCA分支形成ICA、ECA分叉約3 mm處剪一小口，將尼龍線栓由CCA插入，松開動脈夾，到達19 mm時感到稍許阻擋，表明線栓頭側已到達大腦中動脈，緊緊結扎ICA遠心端細線后將傷口縫合，在皮膚上固定好線栓末端。缺血120 min后拔出1 cm左右線栓，造成再灌注模型。術后20 ℃環(huán)境下常規(guī)進食、水及飼養(yǎng)。假手術組造成缺血狀態(tài)但不作再灌注，其余操作及步驟與造模組一致。待麻醉醒后，生命各體征穩(wěn)定，參照Zea Lonnga五級5分標準[9]評分，評分為1～3分者入組，解剖后取腦可見梗塞區(qū)域在缺血顳葉皮質，與大腦中動脈供血區(qū)域一致，提示模型成功。取腦時若有顯著的蛛網膜下腔出血的大鼠則剔除試驗。剔除不符合試驗標準者后，以同樣的造模方式進行補齊。

1.3? 選穴及針刺方法

穴位選取參照《實驗針灸學》[9]《實驗動物穴位圖譜》[10]及人體骨度分寸法。大椎：直刺0.5 cm;百會：平刺0.1 cm;人中：向鼻中隔方向斜刺0.2 cm。

1.4? 干預方法

正常組不做任何處理，其他組成功造模后待大鼠呼吸、心率等生命體征穩(wěn)定之后處理如下：假手術組與模型組動物僅做綁扎，時間為0.5 h;依達拉奉組捆綁并腹腔注射3 mg/kg（稀釋至1 mL），時間為0.5 h;針刺組于綁扎后行針刺治療，每個穴位行針捻轉60 s，每15 min行針1次，留針0.5 h后松綁。各組大鼠每隔12 h行1次捆綁/治療，72 h后行神經功能缺損評分，再用10%水合氯醛麻醉并處死。

1.5? 觀察指標及檢測方法

1.5.1? 神經功能缺損評分? 神經功能缺損評分參照Zea Longa 5分法[9]，將實驗大鼠評分后，再行再灌注，待大鼠清醒后，完成治療對其再次做神經功能缺損評分。具體如下：0分，無神經功能損傷癥狀;1分，提尾時栓塞動脈對側前肢不能伸直;2分，行走時向栓塞動脈對側旋轉;3分，行走時向栓塞動脈對側傾倒;4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.5.2? Western blot法檢測ES表達? 大鼠完成治療并腹腔麻醉致死后，斷頭后分離缺血區(qū)海馬的組織塊，冰NaCl10%沖洗后取5 mm×5 mm大小，固定于4%多聚甲醛24 h后石蠟包埋、切片。剪取0.025 g組織塊，冰預冷PBS洗組織，加入200 ？滋L RIPA裂解液于勻漿器中反復研磨組織直至看不見組織塊，冰上，蛋白裂解10 min，離心后分裝置于離心管中;測定蛋白濃度后電泳、轉膜后，用1×TBST配制的5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置90 min。一抗（Rabbit-bs-0547R）與膜共同孵育，4 °C過夜;二抗（HRP Proteintech-Rabbit）與膜共同孵育90 min，洗色后ECL顯色并曝光，顯影沖洗，底片掃描后用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析，計算結果。

1.6? 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0軟件進行處理，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用“x±s”表示;多組計量資料采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法，計數(shù)資料采用？字2檢驗。不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗，用中位數(shù)和四分位間距[M（Q）]描述。

2 結果

2.1? 針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能缺損評分的影響

治療后，各組大鼠大腦組織行切片后用TTC染色，紅色的染色區(qū)為正常組織區(qū)域，白色的染色區(qū)為梗死灶，正常組與假手術組未見梗死區(qū)，其余3組均有大小不同的梗死灶。治療前，與正常組及假手術組比較，其余3組神經功能缺損評分均較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示造模成功。各組治療前后比較，依達拉奉組與針刺組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且依達拉奉組、針刺組低于模型組（P<0.01）。見圖1、表1。

2.2? 針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬ES表達的影響

與正常組及假手術組比較，模型組、針刺組和依達拉奉組ES的表達程度均上升，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，針刺組、依達拉奉組ES的表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與針刺組比較，依達拉奉組ES表達降低，但依達拉奉組與針刺組之間ES表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2，表2。

3 討論

ES可抑制內皮細胞生長，誘導內皮細胞凋亡，在下調血管內皮組織再生與增殖有著重要的作用。研究表明：大腦中動脈栓塞后，缺血半暗區(qū)ES顯著上升，并隨著時間的延長呈增長趨勢[11]。針刺可抑制炎性反應，抑制腦水腫形成，抑制細胞凋亡，促進神經與血管再生等[12]，這與針刺能抑制促凋亡因子的表達有密切關系。丁玲[13]研究發(fā)現(xiàn)電針百會、水溝、足三里可促進MCAO大鼠內血管新生，其作用機制可能與下調ES表達有關。同時針刺“百會”“大椎”穴可有效挽救半影區(qū)缺血神經元，修復損傷神經元，防止其發(fā)生壞死，促進梗死灶周圍正常神經元出芽、再生，并形成新的突觸[14]。針刺可促進腦缺血區(qū)血管新生，增加微血管密度，下調血管再生因子蛋白表達，其機制可能為通過多條通路對細胞凋亡蛋白、增生與分化蛋白、周期蛋白進行調控，抑制缺血腦組織細胞的凋亡、促進細胞增殖來實現(xiàn)對缺血損傷腦組織的保護作用[15]。頭針可抑制ES表達[16-17]，促進血管內皮細胞增殖、遷移、降解血管基底膜，誘導心血管形成，加速周圍側枝循環(huán)的建立，從而減輕腦缺血損傷。電針能抑制MCAO大鼠腦內血管內皮細胞ES表達[18]，從而促進血管再生，增加腦供血。

本實驗結果證明：腦缺血再灌注損傷后，大鼠神經功能缺損的評分在針刺治療后降低（P<0.01），且針刺組治療后腦組織ES的表達降低（P<0.05），提示針刺能促進ES的抑制生長，使腦缺血再灌注損傷后大鼠神經功能缺損評分降低，同時能明顯降低大鼠ES表達，降低腦缺血再灌注損傷風險。其效應機制可能與通過針刺下調ES表達，促進腦血管新生有關。針刺組與依達拉奉組ES的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明針刺治療與依達拉奉對CIRI后大鼠下達ES表達效應相當。由此推測，針刺大椎、百會、人中穴能更有效地下調CIRI大鼠大腦缺血側海馬ES的表達水平，從而實現(xiàn)對腦保護的作用。

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