陳小敏　譚書明　王瑞　唐明權(quán)

摘 要：本文建立HPLC法檢測(cè)獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量。色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），甲醇-水體系（12：88）為流動(dòng)相，柱溫30℃，進(jìn)樣體積 5 μL ，檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm，流速 0.5 mL/min，等濃度洗脫，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，得到儀器的最低檢出限為0.001 mg/kg，加標(biāo)回收率（n=9）在 88.96%～97.97%范圍內(nèi)，儀器精密度RSD為1.077%，方法精密度RSD為4.275%。在此色譜條件下測(cè)得獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量為1.387 mg/mL。

關(guān)鍵詞：乙酰丙酸;獼猴桃;高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：TS201

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）04-0076-05 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.04.014

Determinetion of Levulinic Acid in Kiwi Fruit Peel Transforming Liquid by HPLC

CHEN Xiao-min1，TAN Shu-ming2*，WANG Rui3，TANG Ming-quan3

（1. College of Brewing and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.College of Life Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;3. School of Food and Pharmaceutical Engineering，Guiyang College，Guiyang，Guizhou 550003，China）

Abstract：HPLC method was established to detect the content of transformation solution of levulinic acid in kiwi fruit peel. Methods： Chromatographic column was Agilent HC-C18 column （150 mm x 4.6 mm x 5 microns），methanol-water system （12：88） as mobile phase at a flow rate of 0.5 mL/min，the column temperature was 30 ℃，the injecting volume was 5 uL and the detection wavelength was at 266 nm，Elution of the same concentration，quantitative by external standard method. Results： The method was good linear correlation within the range of 0.2 mg/mL ～ 1.0 mg/mL for levulinic acid，and the minimum detection limit of the instrument was 0.001 mg/kg. The levulinic acid standard recovery （n=9） were within the range of 88.96% ～ 97.97%，the precision RSD of the instrument was 1.077% and the method was 4.275%. For all conditions to measurement what the content of levulinic acid was 1.387 mg/mL.

Key words：Levulinic acid; Kiwi fruit; HPLC

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，化石能源的枯竭，不可再生資源的供應(yīng)緊張及使用石油資源等引起的溫室效應(yīng)、臭氧層破環(huán)、酸雨等問(wèn)題，已成為全球人民熱議的話題。所以，人們尋找新的替代能源已成為當(dāng)今社會(huì)刻不容緩的問(wèn)題。生物質(zhì)因其儲(chǔ)存量豐富、可持續(xù)發(fā)展、對(duì)環(huán)境破壞小等特點(diǎn)被視為未來(lái)最重要的可替代能源之一[1-2]。生物質(zhì)是指通過(guò)光合作用而產(chǎn)生可再生的或可循環(huán)的有機(jī)物質(zhì)，化學(xué)組分可分為木質(zhì)纖維素、淀粉和油脂[3]。隨著研究的不斷深入，通過(guò)生物質(zhì)反應(yīng)得到的價(jià)格低廉、用途廣泛的綠色平臺(tái)化合物逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

美國(guó)報(bào)告和2010年新修訂的平臺(tái)化合物中指出了乙酰丙酸是一種具有代表性的綠色平臺(tái)化合物[4-6]。乙酰丙酸 （ Levulinic acid，LA ） ，又名左旋糖酸或果糖酸[7]?？赏ㄟ^(guò)木質(zhì)纖維素水解得到，而且因其官能團(tuán)特性使其能夠通過(guò)多種化學(xué)反應(yīng)來(lái)制備各種高附加值化學(xué)品[8]。衍生出來(lái)的化學(xué)品在電子產(chǎn)品、香料、食品、化妝品、醫(yī)藥、燃料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[9-10]。所以對(duì)乙酰丙酸的研究與測(cè)定必不可少，目前乙酰丙酸的檢測(cè)方法有薄層掃描法[11]、香草醛-硫酸法[12-13]、離子色譜法[14-15]、氣相色譜法等[16-17]。但每種方法都有不足之處，薄層掃描法對(duì)乙酰丙酸的測(cè)定只能半定量、香草醛-硫酸法只能定性不能準(zhǔn)確定量、氣相色譜法前處理復(fù)雜，成本高、離子色譜法設(shè)備要求高，裝置復(fù)雜，色譜柱非常昂貴，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)。高效液相色譜（high performance liquid chromatogram，HPLC） 法因處理樣品簡(jiǎn)單、快速，且能同時(shí)測(cè)定幾種成分而被廣泛應(yīng)用于各類化合物的檢測(cè)[18]。通過(guò)對(duì)以上檢測(cè)方法的比較與參考，本文以獼猴桃果皮為生物質(zhì)原料來(lái)制備乙酰丙酸，建立高效液相色譜法對(duì)獼猴桃轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量進(jìn)行檢測(cè)，尋找一種更快速、便捷、有效的檢測(cè)方法，為乙酰丙酸的檢測(cè)尋找更多、更有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

獼猴桃：購(gòu)于貴州省貴陽(yáng)市修文縣。

1.2 試劑

乙酰丙酸、分析純：北京百靈威科技有限公司;甲醇，AR：Aladdin Chemistry Co;純凈水：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 儀器

LC-15C高效液相色譜儀：日本島津公司;KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司;MA110電子天平：上海良平儀器儀表有限公司;UV-2700紫外分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取 0.50026 g（精確至0.0001 g）乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品，用純凈水配成濃度為 100 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存于4℃冰箱備用。

1.4.2 樣品溶液的制備

量取獼猴桃果皮壓榨制備的汁液25 mL，稱取經(jīng)氨水滴定法并高溫煅燒過(guò)所制得的催化劑P2O5 0.5 g，兩者同時(shí)加入高溫反應(yīng)釜中在 190℃ 高溫下反應(yīng) 20 min提取獼猴桃汁液中的乙酰丙酸，過(guò)濾并定容到50 mL 的容量瓶中得樣品液1瓶。用100～1000 uL 的移液槍取 2 mL的樣品溶液于 10 mL 的容量瓶中加純凈水至刻度線，搖勻放入 4℃的冰箱備用。

1.4.3 確定最大吸收波長(zhǎng)

利用紫外分光光度計(jì)在200～450 nm處，對(duì)乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次波長(zhǎng)掃描取平均值，確定最大紫外吸收波長(zhǎng)。

1.4.4 確定最佳流速

確定甲醇-水體系（12∶88）為流動(dòng)相;色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;柱溫30℃;進(jìn)樣體積 5 μL ;檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm，更換0.3、0.5、0.8 mL/min三種流速;每種流速條件下分別對(duì)乙酰丙酸標(biāo)樣及乙酰丙酸樣品進(jìn)樣，比較標(biāo)樣出峰對(duì)應(yīng)的時(shí)間下樣品的分離情況，篩選出最佳的流速。

1.4.5 確定最佳流動(dòng)相

色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;柱溫30℃;進(jìn)樣體積 5 μL ;檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm;流速 0.5 mL/min，等濃度洗脫?？刂屏鲃?dòng)相甲醇與水的體積比分別為：10∶90、12∶88、20∶80、30∶70四種比例;在每種流動(dòng)相比例條件下分別對(duì)乙酰丙酸標(biāo)樣及乙酰丙酸樣品進(jìn)樣，比較在標(biāo)樣對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間下樣品的出峰情況，觀察乙酰丙酸的分離情況，篩選出最佳流動(dòng)相比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件

2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

利用紫外檢測(cè)器，在200～450 nm處對(duì)乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行最大紫外吸收波長(zhǎng)的掃描，掃描3次取平均值（圖1）。當(dāng)波長(zhǎng)在266 nm時(shí)，乙酰丙酸吸光度為1.086達(dá)到最大紫外吸收，確定266 nm為乙酰丙酸的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相比例

色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;柱溫30℃;進(jìn)樣體積 5 μL ;檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm;流速 0.5 mL/min，等濃度洗脫?？刂屏鲃?dòng)相甲醇與水的體積比分別為：10∶90、12∶88、20∶80、30∶70四種比例;在每種流動(dòng)相比例條件下分別對(duì)乙酰丙酸標(biāo)樣及樣品進(jìn)樣，比較在標(biāo)樣對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間下樣品的出峰情況，觀察乙酰丙酸的分離情況。圖2從上到下流動(dòng)相水與甲醇比依次為90∶10、88∶12、80∶20、70∶30，可以看出當(dāng)流動(dòng)相比例為88∶12時(shí)，乙酰丙酸能被很好的分離。

2.1.3 流速的選擇

確定甲醇-水體系（12：88）為流動(dòng)相;色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;柱溫30℃;進(jìn)樣體積 5 μL ;檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm，流速分別為：0.3、0.5、0.8 mL/min時(shí)，如圖3（從上到下依次為0.3、0.5、0.8 mL/min）可以看出當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí)乙酰丙酸能被很好的分離，沒(méi)有雜質(zhì)峰的干擾;當(dāng)流速為0.3 mL/min時(shí)，由于流速較低乙酰丙酸沒(méi)有被分離，流速到0.8 mL/min時(shí)乙酰丙酸也沒(méi)有被分離出來(lái)，確定最佳流速為0.5 mL/min。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品0.50026 g，用純凈水配成濃度為100 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在5支10 mL容量瓶中分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成濃度為：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)濃度的溶液在優(yōu)化的色譜條件下用HPLC重復(fù)三次進(jìn)樣，峰面積取平均值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=98449x-526.4（y為峰面積，x為乙酰丙酸的濃度）：相關(guān)系數(shù)R為0.9999，標(biāo)準(zhǔn)曲線以及線性方程（圖4）。

2.1.5 檢出限

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到，當(dāng)乙酰丙酸達(dá)到一定濃度時(shí)，色譜柱由于過(guò)載，保留時(shí)間前移，不能準(zhǔn)確定性，根據(jù)信噪比S/N=3計(jì)算，該方法檢出限為0.001 mg/kg。

2.1.6 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.60 mg/mL的乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在優(yōu)化的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣7次，測(cè)定峰面積如表1，結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積RSD為1.077%（n=7），表明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品溶液按相同的處理方法平行制備7份樣品進(jìn)樣液，在優(yōu)化的色譜條件下對(duì)7份樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果按表2測(cè)定的峰面積來(lái)計(jì)算，RSD為4.275%（n=7）。

2.1.8 回收率試驗(yàn)

取已知濃度的獼猴桃轉(zhuǎn)化液9份，加入等體積已知濃度的乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用高效液相色譜重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算回收率（如表3），結(jié)果得到平均回收率為88.96%～97.97%。

2.1.9 樣品溶液的測(cè)定

將1.4.1和1.4.2中制備的乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)樣分析檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液出峰時(shí)間吻合，峰面積為13131，代入公式y(tǒng)=98449x-526.4，經(jīng)過(guò)計(jì)算得生物質(zhì)轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量為1.387mg/mL。

3 結(jié)論與討論

乙酰丙酸是一種具有代表性的綠色平臺(tái)化合物，可通過(guò)生物質(zhì)反應(yīng)得到，被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、有機(jī)合成中間體、香料原料、聚合物、塑料改性劑、樹脂、潤(rùn)滑油、橡膠助劑、印刷油墨及涂料的添加劑等，涉及到化工、醫(yī)藥、化妝品、食品、紡織、電子產(chǎn)品等眾多領(lǐng)域。因此，建立一種高效、快速、專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法意義重大。

本文建立了獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的 HPLC 檢測(cè)方法，最佳的色譜條件為：流動(dòng)相 A 為 88%的水溶液，流動(dòng)相 B 為 12%的水溶液，色譜柱AgilentHC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 266 nm，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積 5 μL，等濃度洗脫。在此色譜條件下，得到乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=98449x-526.4（y為峰面積，x為乙酰丙酸的濃度）：相關(guān)系數(shù)R為0.9999，在 0.2 mg/mL～1 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均回收率為88.96%～97.97%，表明方法準(zhǔn)確可信。精密度RSD為1.077%（n=7），變異系數(shù)低于 2%，表明儀器的精密度良好。

利用建立的色譜條件檢測(cè)出獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量為1.387 mg/mL。但本文不足之處是只用一種生物質(zhì)轉(zhuǎn)化液來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，如果利用不同的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化液來(lái)檢測(cè)其中的乙酰丙酸含量，其結(jié)果更具有說(shuō)服力。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 張建安，劉德華.生物質(zhì)能源利用技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

[2] 李海濱，袁振宏，馬曉茵.現(xiàn)代生物質(zhì)能利用技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012.

[3] Alonso David Martin，Bond Jesse Q，Dumesic James A，Catalytic conversion of biomass to biofuels[J]. Green Chemistry ，2010，12：1493-1513.

[4] Werpy T，Petersen G.Top value added chemicals from biomass volume I，results of screening for potential candidates from sugars and synthesis gas[M]. Energy efficiency and renewable energy ，2004.

[5] Bozell J J，Petersen G R.Technology development for the production of biobased products from biorefinery carbohydrates—the US Department of Energy’s “Top 10” revisited[J]. Green Chemistry ，2010，12（4）：539-554.

[6] Serrano-Ruiz J C，West R M，Dumesic J A.Catalytic conversion of renewable biomass resources to fuels and chemicals[J]. Annual review of chemical and biomolecular engineering ，2010，1：79-100.

[7] 鄭文靜，崔媛媛，許琳琳，等.乙酰丙酸制備工藝的研究現(xiàn)狀[J].甘蔗糖業(yè)，2018（2）：59-64.

[8] 吳樹翔.乙酰丙酸催化轉(zhuǎn)化及固體酸催化傅克?；芯縖D].聊城：聊城大學(xué)，2018.

[9] 蔡 磊，呂秀陽(yáng)，何 龍，等.新平臺(tái)化合物乙酰丙酸制備方法研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工，2003，23 （4）：14-16.

[10] 常 春，馬曉建，岑沛霖.新型綠色平臺(tái)化合物乙酰丙酸的生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2005，24 （4）：350-356.

[11] 粟 暉，葛 軍.斜投影-不展開薄層色譜法對(duì)廢木料液化產(chǎn)物乙酰丙酸的過(guò)程分析[J].色譜，2014，32（1）：100-104.

[12] 賀才珍，潘秋華.醬油中乙酰丙酸含量的半定量分析方法[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，32（4）：100-102.

[13] 蘇 萍，黃谷亮，等.甘蔗渣水解液中乙酰丙酸的定性檢測(cè)[J].廣西蔗糖，2008（3）：44-45.

[14] 隋小玉，林 鹿.離子色譜法測(cè)定葡萄糖水解液中乙酰丙酸的含量[J].食品科技，2010，35（3）：281-284.

[15] 任 飛，楊娟芬，許迪明，等.離子色譜法測(cè)定醬油中乙酰丙酸[J].分析試驗(yàn)室，2008，27（S2）：126-128.

[16] 林澤鵬，許少美，林 晨，等.氣相色譜法測(cè)定6大類食品中乙酰丙酸的含量[J].食品工業(yè)，2018，39（11）：295-297.

[17] 蔡 磊，呂秀陽(yáng)，何 龍，等.氣相色譜法直接分析生物質(zhì)水解產(chǎn)物中的乙酰丙酸[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2004（6）：104-105.

[18] 宋俊蓉，婁華勇，方友來(lái)，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素的含量[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2018，37（3）：79-83，89.