張靜嫻　胡青　董洪霜　孫健　馮?！∮阢埉d　毛秀紅　季申

摘要?目的：建立以特征肽為檢測指標(biāo)的阿膠糕中阿膠的鑒別方法與馬皮、牛皮、羊皮、豬皮源成分的檢測方法。方法：采用三氯乙酸沉淀法提取阿膠糕中的蛋白質(zhì)，胰蛋白酶進(jìn)行酶解處理，利用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法（UHPLC-QQQ MS），電噴霧離子源（ESI），正離子模式下掃描，采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式，對(duì)特征肽目標(biāo)離子進(jìn)行檢測。結(jié)果：經(jīng)驗(yàn)證，鑒別方法和檢查方法均均有良好的專屬性，靈敏度高。市售樣品測定結(jié)果顯示，部分樣品中檢出阿膠成分，有的樣品中檢出牛皮源成分，有的樣品中未檢出任何皮源性成分。結(jié)論：所建立方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，可用于阿膠糕中阿膠的鑒別和摻假雜皮膠的檢測。

關(guān)鍵詞?阿膠;阿膠糕;超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法;多重反應(yīng)檢測;特征肽;蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù);膠原蛋白

Development of UHPLC-QQQ MS Method for Identification of Donkey-hide Gelatin Cake and Detection of Constituents from Horse，Ox，Sheep or Pig Skin

Zhang Jingxian，Hu Qing，Dong Hongshuang，Sun Jian，F(xiàn)eng Rui，Yu Hong，Zhang Su，Mao Xiuhong，Ji Shen

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To establish a method for the identification of colla corii asini in donkey-hide gelatin cake and the detection of constituents from horse，ox，sheep or pig skin with characteristic peptide as the detection marker.Methods：The protein was extracted by trichloroacetic acid precipitation method，and trypsin was used for enzymatic hydrolysis.UHPLC-QQQ MS was used with electrospray positive ionization mode and multiple reaction monitoring（MRM）to detect the target ions.Results：The method was validated to be specific and sensitive.The results showed that some samples were found to be containing colla corii asini and some samples containing bovine skin ingredients，whereas some samples did not detect any skin-derived constituents.Conclusion：The established method was validated to be simple and specific.It can be used for identification of colla corii asini in donkey-hide gelatin cake and detection of adulteration.

Key Words?Colla corii asini; Donkey-hide gelatin cake; UHPLC-QQQ MS; MRM; Characteristic peptide; Proteomics; Collagen

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.008

阿膠糕是以阿膠、黑芝麻、核桃仁等為主要原料，添加冰糖、黃酒等輔料，經(jīng)配料、熬制等過程制成的可以即食的產(chǎn)品。阿膠具有補(bǔ)血養(yǎng)氣、美容養(yǎng)顏、潤腸通便、抗衰老、提高免疫力的綜合保健功效，可用于失血貧血、缺鐵貧血、再生障礙性貧血等[1-6]。

近年來，隨著人民生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，阿膠市場逐年擴(kuò)大，阿膠糕具有食用方便，口感好的特點(diǎn)，迅速在市場上崛起。隨著阿膠市場的擴(kuò)大，阿膠原料驢皮資源短缺，價(jià)格上漲，部分生產(chǎn)企業(yè)為降低成本，采用馬、騾、牛、羊等價(jià)格相對(duì)低廉的皮制造阿膠，生產(chǎn)阿膠糕類食品，嚴(yán)重影響著患者和消費(fèi)者的飲食用藥安全。

目前關(guān)于阿膠糕類食品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，山東東騰阿膠有限公司的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（Q/DT 0001S-2018），對(duì)總糖、水分、蛋白質(zhì)、總砷、鉛、酸價(jià)及過氧化值等理化指標(biāo)進(jìn)行限值規(guī)定[7]，2014年山東省食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布“關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)阿膠糕類食品生產(chǎn)許可工作有關(guān)問題的通知”，指出阿膠糕類產(chǎn)品不應(yīng)添加明膠[8]。顏等[9]通過測定總氨基酸的含量來調(diào)查阿膠類保健食品中阿膠的投料量，其中6批樣品未檢出特異性氨基酸L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸，市場不容樂觀，由于氨基酸作為檢測指標(biāo)缺乏專屬性，難以對(duì)其他雜皮造假和摻假的現(xiàn)象進(jìn)行檢測和監(jiān)管。因此，為了規(guī)范阿膠糕類市場，打擊部分企業(yè)的不良行為，保證消費(fèi)者的飲食安全，急需建立阿膠糕類食品的專屬性強(qiáng)的鑒別和檢查方法。

《中華人民共和國藥典》2015年版一部收載阿膠，以特征肽為指標(biāo)進(jìn)行鑒別，同時(shí)測定4個(gè)氨基酸的含量[10]，國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法對(duì)牛皮源成分和鉻進(jìn)行檢測[11]，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施以來，日常檢驗(yàn)中牛皮源成分檢出情況明顯減少。同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道了馬皮源、豬皮源、羊皮源的檢測方法[12-16]，均是以特征肽為指標(biāo)，采用液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，對(duì)嚴(yán)格控制阿膠品質(zhì)具有重要意義。本課題組前期采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以自制阿膠、馬皮膠、牛皮膠、羊皮膠和豬皮膠為研究對(duì)象，采用納流液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法采集肽段信息，通過搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，比較阿膠與雜皮膠的肽段信息，發(fā)現(xiàn)馬皮膠、牛皮膠、羊皮膠、豬皮膠的專屬性特征肽，可作為檢測指標(biāo)用于阿膠及含阿膠食品和藥品的鑒別與檢查。因此，本課題以專屬的特征肽為檢測指標(biāo)建立阿膠糕類食品的鑒別和檢查方法。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（Agilent 1290/Agilent 6495，美國Agilent公司）。

1.2?試劑

甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck公司）、甲酸為色譜純（美國Fisher公司），胰蛋白酶為測序級(jí)（美國Promega公司），水為去離子水（Milli-Q純水系統(tǒng)生產(chǎn)），碳酸氫銨為分析純（上海國藥集團(tuán)）。

1.3?分析樣品

對(duì)照藥材與對(duì)照品：阿膠（批號(hào)121274-201202）對(duì)照藥材由中國食品藥品鑒定研究院提供，馬皮特征肽、牛皮特征肽、羊皮特征肽和豬皮特征肽對(duì)照品均由吉爾生化（上海）有限公司合成，純度均大于98%。

樣品：研究用阿膠糕樣品為實(shí)驗(yàn)室自制，同時(shí)自制阿膠糕陰性樣品。最終檢測的10批阿膠糕為市售樣品。

2?方法與結(jié)果

2.1?特征肽及檢測離子的確定

參照阿膠藥材質(zhì)量控制方法，選擇《中華人民共和國藥典》2015年版一部中阿膠鑒別用檢測離子，即m/z 539.8→924.5，612.3（見表1），用于建立阿膠糕中阿膠的鑒別方法。同時(shí)參考文獻(xiàn)[12-13]，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，提取阿膠及馬、牛、羊和豬自制膠中的膠原蛋白，進(jìn)行酶解，采用納流液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法（UltiMate 3000 Nano RSLC-Orbitrap Fusion Lumos HRMS）采集肽段信息，采用Proteome Discoverer 2.2軟件通過搜索各個(gè)物種相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（驢：NCBI Equus_asinus protein;馬：uniprot horse_UP000002281;牛：uniprot Bovine_UP000009136;羊uniprot sheep_UP000002356豬：uniprot pig_UP000008227），進(jìn)行蛋白質(zhì)和多肽的鑒定，比較阿膠與雜皮膠的肽段信息，尋找馬皮膠、牛皮膠、羊皮膠、豬皮膠的專屬性特征肽。見表1。正離子模式下的二級(jí)掃描質(zhì)譜圖如圖1所示，主要是酰胺鍵斷裂后產(chǎn)生的b離子和y離子，對(duì)主要的碎片離子進(jìn)行了歸屬。選擇響應(yīng)好且相對(duì)穩(wěn)定的離子對(duì)作為檢測指標(biāo)，采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法對(duì)各離子的碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，特征肽序列及質(zhì)譜離子信息見表1。

2.2?液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters CORTECS T3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃，流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈溶液;梯度洗脫程序：0～15 min，95%A→80%A，5%B→20%B;進(jìn)樣量：1 μL。

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式;離子源溫度：200 ℃，毛細(xì)管電壓：4 000 V，干燥器流量：12 L/min;霧化器壓力：25 psi;鞘氣溫度：250 ℃;鞘氣流量：10 L/min;噴嘴電壓：500 V;采用多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測。特征肽的母離子、子離子和碰撞能量（CE）等信息見表1。

2.3?樣品溶液的制備

2.3.1?阿膠對(duì)照藥材溶液的制備

按照《中華人民共和國藥典》2015年版一部“阿膠”鑒別項(xiàng)下制備阿膠對(duì)照藥材溶液。取對(duì)照藥材0.1 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液（1 μg/μL）10 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.3.2?樣品溶液的制備

取阿膠糕適量，去除易分離的其他食材（如花生、核桃等）后，取膠類部位1 g，加適量水超聲30 min使溶解，離心，取上清液，加入等量預(yù)冷的20%三氯乙酸溶液，充分振蕩后于4 ℃放置30 min，離心，棄去上清，取沉淀，用預(yù)冷丙酮2 mL洗滌，離心，棄去丙酮液，再用2 mL預(yù)冷丙酮重復(fù)洗滌一次，揮干丙酮，得蛋白提取物。于提取物中加入1%碳酸氫銨溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，取100 μL續(xù)濾液，加入10 μL胰蛋白酶溶液（1 μg/μL），搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.3.3?用于雜皮源成分檢測的對(duì)照品溶液制備

取研究用自制阿膠糕，按照樣品溶液的制備方法得阿膠糕基質(zhì)溶液。分別取馬、牛、羊、豬特征肽適量，加阿膠糕基質(zhì)溶液制成各特征肽質(zhì)量濃度為1 μg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。系列標(biāo)準(zhǔn)溶液用阿膠糕基質(zhì)溶液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。取各標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，加胰蛋白酶溶液（1 μg/μL）10 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.4?方法學(xué)考察

2.4.1?阿膠糕中阿膠鑒別

專屬性考察：以不含阿膠的自制糕為陰性樣品，以阿膠對(duì)照藥材和阿膠糕為陽性樣品，選擇特征離子峰m/z 539.8→612.4和m/z 539.8→923.8作為檢測離子對(duì)進(jìn)行測定，結(jié)果陰性樣品中的色譜圖中（圖2），在與阿膠對(duì)照藥材及阿膠糕相應(yīng)的位置上無相應(yīng)色譜峰，說明方法的專屬性良好。

檢測限考察：自制阿膠糕，使阿膠含量分別占總量的0.1%、0.5%、1.0%，按照樣品制備方法提取蛋白、酶解成肽段后，對(duì)阿膠特征肽離子對(duì)m/z 539.8→924.5，612.3進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，阿膠含量為0.1%時(shí)可檢測到相應(yīng)離子對(duì)。

2.4.2?阿膠糕中馬皮、牛皮、豬皮、羊皮源成分的檢測

專屬性考察：以自制馬皮膠、牛皮膠、豬皮膠和羊皮膠為陽性樣品，以自制阿膠糕為陰性樣品，選擇各雜皮膠特征肽檢測離子對(duì)進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。在陽性樣品中，各特征肽對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間位置上均呈現(xiàn)出特征肽離子流色譜峰。而阿膠樣品色譜圖中，在與馬皮膠、牛皮膠、豬皮膠和羊皮膠相應(yīng)特征肽的保留時(shí)間位置未檢出色譜峰，說明各雜皮膠的特征肽專屬性良好。

檢測限考察：取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，各特征肽濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明各組分在0.01～1.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在阿膠糕基質(zhì)溶液中加入適量的雜皮膠特征肽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按照方法進(jìn)樣檢測，以信噪比為3計(jì)算檢測限，結(jié)果顯示馬、牛、羊、豬特征肽的檢測限分別為0.8、1.1、0.9、1.2 μg/kg。

2.5?樣品測定結(jié)果

以所建立的方法對(duì)市場上購買的阿膠糕進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，10批樣品中，有5批檢出阿膠成分，未檢出其他皮源性成分;有2批樣品檢出牛皮源成分，另外3批未檢出任何皮源性成分，可能是未投料或者投料過少，低于目前檢測限。

3?討論

阿膠及各雜皮膠主要成分均為膠原蛋白，同源性高，近年來，以特征肽為檢測指標(biāo)，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立膠類中藥質(zhì)量控制方法，得到了廣泛應(yīng)用，該方法具有專屬性強(qiáng)，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[15-19]。但是，如何選擇專屬性強(qiáng)的特征肽是方法開發(fā)的關(guān)鍵因素[20]，本研究前期采用納流液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱-線性離子阱三合一組合式高分辨質(zhì)譜儀（nanoLC/Orbitrap Fusion Lumos HRMS）對(duì)自制阿膠、馬皮膠、羊皮膠和豬皮膠的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，采用蛋白質(zhì)搜庫軟件，搜索相應(yīng)物種的蛋白數(shù)據(jù)庫，鑒定主要蛋白質(zhì)和肽段，并對(duì)阿膠及雜皮膠進(jìn)行了比較，選擇其中每個(gè)物種專屬的特征肽，作為檢測指標(biāo)，來建立阿膠糕中摻假雜皮膠的檢測方法。

阿膠糕中除阿膠原料外，還含有芝麻、花生、核桃仁、冰糖，黃酒等，樣品基質(zhì)復(fù)雜，因此需要考察膠原蛋白的提取和富集方法。實(shí)驗(yàn)首先按照阿膠藥材鑒別中的供試品制備方法，即直接取樣，約相當(dāng)于阿膠含量0.1 g，用1%碳酸氫銨50 mL超聲30 min，過濾，取濾液100 μL酶解后進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)特征肽信號(hào)非常弱，由于樣品中的糖類、油脂及其他蛋白質(zhì)會(huì)一同提取出來，這些成分對(duì)酶解效率和質(zhì)譜響應(yīng)可能有抑制作用，因此，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了富集蛋白質(zhì)的方法，首先剝離除去花生、核桃仁等體積較大的成分，從而去除一部分油脂，取膠類部位樣品，用水超聲溶解后，加入等體積預(yù)冷的20%三氯乙酸低溫沉淀蛋白，用預(yù)冷丙酮洗滌沉淀，從而獲得蛋白提取物，酶解后進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜響應(yīng)明顯提高。

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