川芎嗪對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨下骨中miR—20b/VEGF和BMP2/Smad1通路的影響

梁桂洪 梁祖建 謝平金 潘建科 曾令烽 楊偉毅 黃和濤 韓燕鴻 劉軍

中圖分類(lèi)號(hào) R274.9；R96 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）04-0448-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.04

摘 要 目的：研究川芎嗪對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）模型大鼠軟骨下骨中微小核糖核酸miR-20b/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）/Smad1通路的影響，并探討川芎嗪防治KOA的作用機(jī)制。方法：取健康雄性SD大鼠18只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、川芎嗪組，每組6只。對(duì)后兩組大鼠通過(guò)膝關(guān)節(jié)腔注射4%木瓜蛋白酶溶液建立KOA模型。末次注射后第2天起，川芎嗪組大鼠灌胃川芎嗪混懸液（100 mg/kg）2 mL，正常對(duì)照組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。給藥結(jié)束后，暴露大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行大體情況觀(guān)察。截取大鼠膝關(guān)節(jié)，進(jìn)行切片和蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀(guān)察組織病理學(xué)變化，并采用改良的Mankin’s評(píng)分進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的mRNA表達(dá)和miR-20b表達(dá)水平；采用Western Blot法檢測(cè)VEGF、BMP2、Smad1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：模型組和川芎嗪組大鼠的膝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)不同程度的軟骨損傷；與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin’s評(píng)分顯著升高（P<0.01）；軟骨下骨組織中BMP、Smad1的mRNA和蛋白表達(dá)以及miR-20b表達(dá)水平均顯著降低，VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin’s評(píng)分顯著降低（P<0.01）；軟骨下骨組織中BMP、Smad1的mRNA和蛋白表達(dá)以及miR-20b表達(dá)水平均顯著升高，VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：川芎嗪能修復(fù)KOA模型大鼠損傷的關(guān)節(jié)軟骨，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)軟骨下骨中miR-20b表達(dá)水平，促進(jìn)VEGF mRNA降解繼而抑制VEGF蛋白的表達(dá)，同時(shí)激活BMP-2/Smad1信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 川芎嗪；膝骨性關(guān)節(jié)炎；軟骨下骨；大鼠；miR-20b；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；Smad；作用機(jī)制

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of ligustrazine on miR-20b/VEGF and BMP2/Smad1 pathways in subchondral bone of knee osteoarthritis （KOA） model rats， and to investigate the mechanism of ligustrazine for KOA prevention and treatment. METHODS： Totally 18 healthy male SD rats were randomly divided into normal control group， model group and ligustrazine group， with 6 rats in each group. The rats in the latter two groups were used to establish KOA model by intra-articular injection of 4% papain solution. From the 2nd day after the last injection， ligustrazine group was given intragastrical administration of Ligustrazine suspension （100 mg/kg） 2 mL； normal control group and model group were given intragastrical administration of isometrical normal saline， once a day， for consecutive 6 weeks. After the last after medication， the situation of bilateral knee articular cartilage of rats were observed after exposure. The knee joints of rats were sectioned and stained with HE. The pathological change of articular cartilage were observed by microscope and scored by modified Mankin’s score. mRNA expression of VEGF， BMP2 and Smad1， and the expression of miR-20b were detected by RT-PCR； the protein expression of VEGF， BMP2 and Smad1 were detected by Western blot assay. RESULTS： Model group and ligustrazine group suffered from cartilage injury of knee joint at varying degrees. Compared with normal control group， Mankin’s scores of knee joint and cartilage tissue were increased significantly in model group （P<0.01）； mRNA and protein expression of BMP and Smad1， the expression of miR-20b in subchondral bone of model group were decreased significantly， while mRNA and protein expression of VEGF were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， Mankin’s score of cartilage tissue were decreased significantly in ligustrazine group （P<0.01）； mRNA and protein expression of BMP and Smad1， the expression of miR-20b in subchondral bone were increased significantly， while mRNA and protein expression of VEGF were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Ligustrazine can repair damaged articular cartilage in KOA model rats， the mechanism of which may be associated with inhibiting the protein expression of VEGF and activating BMP-2/Smad1 signaling pathway via up-regulating the expression of miR-20b， and promoting the degradation of VEGF mRNA in subchondral bone.

KEYWORDS Ligustrazine； Knee osteoarthritis； Subchondral bone； Rat； miR-20b； VEGF； BMP； Smad； Mechanism

膝骨性關(guān)節(jié)炎（Knee osteoarthritis，KOA）的發(fā)生與發(fā)展涉及韌帶、肌肉、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨等關(guān)節(jié)周?chē)M織的結(jié)構(gòu)病變，目前大多數(shù)相關(guān)研究主要以軟骨自身修復(fù)為主，而忽略了周?chē)M織或軟骨下骨對(duì)軟骨修復(fù)的影響[1]。近來(lái)有研究者認(rèn)為，在骨關(guān)節(jié)炎（OA）發(fā)生過(guò)程中，軟骨下骨的病變可能早于關(guān)節(jié)軟骨的退變，并提出關(guān)節(jié)軟骨的完整性可能取決于軟骨下骨的力學(xué)性能[2]；另有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控軟骨下骨的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)通路可能有助于促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的再生修復(fù)[3]。由于軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨有共同的組織細(xì)胞起源，BMP-Smad信號(hào)通路可能共同調(diào)節(jié)軟骨下骨的骨重塑和關(guān)節(jié)軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育[4]，因此調(diào)控兩者共有的信號(hào)通路可能在軟骨下骨和軟骨生長(zhǎng)發(fā)育和代謝中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（miRNA）可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)來(lái)干預(yù)關(guān)節(jié)組織的炎性反應(yīng)及血管再生，從而參與OA的進(jìn)展[5]；而在OA患者的軟骨下骨中發(fā)現(xiàn)有大量血管增生，其機(jī)制可能是新生血管侵入鈣化軟骨層及非鈣化軟骨，激活軟骨下骨的重塑過(guò)程，進(jìn)而引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的退變[6]。川芎嗪是從川芎中提取的一種有效活性物質(zhì)，其能通過(guò)上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax、Caspas-3的表達(dá)，從而抑制軟骨細(xì)胞的凋亡[7]；或者通過(guò)降低OA大鼠關(guān)節(jié)液中一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）的含量，對(duì)減輕OA炎性反應(yīng)有一定的作用[8]；或者通過(guò)降低OA患者關(guān)節(jié)液中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）水平從而提高治療效果[9]，但相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。為此，本課題組對(duì)川芎嗪能否通過(guò)調(diào)控膝骨軟骨與軟骨下骨共有的miR-20b/VEGF和BMP2/Smad1信號(hào)通路從而影響軟骨下骨的骨重建過(guò)程進(jìn)行研究，為臨床使用川芎嗪治療KOA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和治療思路。

1 材料

1.1 儀器

XP205型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；RM2125RTS型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；D3024型臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)SCIlogex公司）；7500型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；SMA4000型微量核酸定量?jī)x（美國(guó)Merinton公司）；318型多功能酶標(biāo)儀（上?，F(xiàn)科儀器有限公司）；Aquaplore 3型超純水機(jī)（美國(guó)Aquapro公司）。

1.2 藥品與試劑

磷酸川芎嗪片（麗珠集團(tuán)利民制藥廠(chǎng)，批號(hào)：160703，規(guī)格：50 mg）；木瓜蛋白酶（上海源葉科技有限公司，批號(hào)：S10011，活性：800 U/mg）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DH0006）；Trizol 試劑（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：DP424）；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、苯甲基磺酰氟（PMSF）（杭州弗德生物科技有限公司，批號(hào)分別為FD2001、FD008、FD1001、FD1002、FD100）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0012A）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海星漢生物科技有限公司，批號(hào)：DBI-2220）；PCR引物（廣州四和生物科技有限公司）；熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Genecopoeia公司，批號(hào)：AOPR-1200）；VEGF兔多克隆抗體、BMP2兔多克隆抗體、Smad1兔多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為Ab46154、Ab14933、Ab131371）；β-actin抗體（內(nèi)參）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為3700、BA1054、AR1112）；ECL發(fā)光液（德國(guó)Merck公司）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為雙蒸水。

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠18只，3月齡，體質(zhì)量180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（粵）2016-0023。所有大鼠均在環(huán)境溫度（25±1）℃、濕度68%、12 h光照/黑暗交替的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，任意進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來(lái)水。本實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、川芎嗪組，每組6只。對(duì)模型組、川芎嗪組大鼠采用關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶建立KOA模型：在無(wú)菌條件下以生理鹽水配制4%木瓜蛋白酶溶液，于4 ℃保存，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前4 h取出放至室溫備用；對(duì)大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，在其雙膝關(guān)節(jié)處備皮、消毒并屈曲約45°，從髕骨下緣前內(nèi)側(cè)的膝眼向髁間窩方向進(jìn)針，待明顯有落空感后，針尖抵達(dá)股骨內(nèi)側(cè)髁再回撤2 mm，然后注射4%木瓜蛋白酶溶液（雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔均注射0.2 mL），在第1、4、7天分別注射1次，共注射3次[10]。正常對(duì)照組大鼠同法注射等體積生理鹽水。自造模第1天起，每天驅(qū)趕大鼠活動(dòng)2次，每次1 h，連續(xù)驅(qū)趕1周。

末次注射木瓜蛋白酶或生理鹽水第2天起，川芎嗪組大鼠灌胃川芎嗪混懸液（100 mg/kg，參考文獻(xiàn)[11]確定劑量；取川芎嗪片以生理鹽水配制成適當(dāng)濃度后給藥）2 mL，正常對(duì)照組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。

2.2 大鼠軟骨組織大體情況和組織病理學(xué)觀(guān)察

給藥結(jié)束后，斷頸處死全部大鼠，解剖雙側(cè)膝關(guān)節(jié)并暴露關(guān)節(jié)軟骨，大體觀(guān)察關(guān)節(jié)軟骨光滑度、色澤，表面是否有糜爛、潰瘍及纖維性增生，邊緣是否有骨贅形成等情況。剔除膝關(guān)節(jié)周?chē)募∪饨M織，在脛骨近端1/4至股骨遠(yuǎn)端1/4的范圍截取整個(gè)膝關(guān)節(jié)。一部分膝關(guān)節(jié)組織于-80 ℃條件下保存?zhèn)錅y(cè)；另一部分膝關(guān)節(jié)組織在4 ℃條件下置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，然后脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋制成石蠟標(biāo)本，行厚切片（4～6 μm）。切片以HE染色后在顯微鏡下觀(guān)察；采用改良的Mankin’s評(píng)分[12]對(duì)軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、染色以及潮線(xiàn)的完整性進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分，評(píng)分范圍為0～13分，評(píng)分越高表明軟骨退變?cè)絿?yán)重。

2.3 大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1 的mRNA和miR-20b表達(dá)水平檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下部分凍存膝關(guān)節(jié)組織，采用Trizol試劑分別提取軟骨下骨總RNA和mRNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制得cDNA第一鏈，然后行RT-PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。采用2-ΔΔCt法[13]，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算VEGF、BMP2、Smad1的mRNA表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-20b的表達(dá)水平。

2.4 大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下部分凍存膝關(guān)節(jié)組織，采用全蛋白提取液（RIPA裂解液-蛋白酶抑制劑混合物-蛋白磷酸酶抑制劑混合物-PMSF的體積比為100 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1）提取軟骨下骨全蛋白，采用Bradford比色法測(cè)定蛋白濃度。離心收集軟骨下骨全蛋白，加入SDS蛋白上樣緩沖液×5次，95 ℃孵育5 min，在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。分別采用濃縮膠和分離膠進(jìn)行蛋白電泳，235 mA轉(zhuǎn)膜60～120 min，5%脫脂奶粉封閉1 h。將PVDF膜分別放入VEGF、BMP2、Smad1、β-actin抗體稀釋液（1 ∶ 1 000）3 mL中，4 ℃孵育過(guò)夜，次日以TBST緩沖液洗膜5 min×4次；再將PVDF膜放入二抗稀釋液（1 ∶ 20 000）3 mL中，室溫下平緩搖動(dòng)孵育1 h后，以TBST緩沖液洗膜5 min×4次；采用ECL發(fā)光液顯色。采用Image J 1.46r 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)灰度值，以表示蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有試驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s或Dunnett’s檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠關(guān)節(jié)軟骨大體情況及組織病理學(xué)觀(guān)察結(jié)果

肉眼觀(guān)察可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組和川芎嗪組大鼠的關(guān)節(jié)均出現(xiàn)不同程度的軟骨損傷，包括關(guān)節(jié)軟骨光滑度下降、色澤變暗淡，表面不平整并伴有糜爛，無(wú)骨贅形成。但兩組間大體情況無(wú)明顯差別。組織切片HE染色后在鏡下可見(jiàn)，正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)清晰，軟骨表面完整、光滑，基質(zhì)染色基本均勻；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨淺表層纖維化，表面完整性被破壞，軟骨細(xì)胞成簇增殖、肥大、排列紊亂，潮線(xiàn)不完整或消失，基質(zhì)染色丟失；川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層不平整，偶見(jiàn)少量簇集的軟骨細(xì)胞，基質(zhì)染色尚可。改良的Mankin’s評(píng)分結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠軟骨組織評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，川芎嗪組大鼠軟骨組織評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)顯微圖見(jiàn)圖1，Mankin’s評(píng)分柱形圖見(jiàn)圖2。

3.2 大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的mRNA和miR-20b表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠軟骨下骨組織中VEGF的mRNA表達(dá)水平顯著升高，BMP2、Smad1的mRNA和miR-20b表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，川芎嗪組大鼠軟骨下骨組織中VEGF 的mRNA表達(dá)水平顯著降低，BMP2、Smad1的mRNA和miR-20b的表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的mRNA和miR-20b表達(dá)水平柱形圖見(jiàn)圖3。

3.3 大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP-2、Smad1的蛋白表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠軟骨下骨組織中VEGF的蛋白表達(dá)水平顯著升高，BMP2、Smad1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，川芎嗪組大鼠軟骨下骨組織中VEGF的蛋白表達(dá)水平顯著降低，BMP2、Smad1的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的蛋白電泳圖見(jiàn)圖4，蛋白表達(dá)水平柱形圖見(jiàn)圖5。

4 討論

OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨反應(yīng)性增生及硬化，并伴隨骨贅形成為主要病理特點(diǎn)的疾病，其在臨床上最直觀(guān)的病理改變是軟骨受損、退變，因此對(duì)OA的防治工作主要集中在關(guān)節(jié)軟骨方面[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與OA模型組比較，正常對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組（塞來(lái)昔布）和川芎嗪高、低劑量組（100、50 mg/kg）大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高；與陽(yáng)性藥物組比較，川芎嗪高劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，而川芎嗪低劑量組上述指標(biāo)水平則降低[15]。另通過(guò)研究證實(shí)，川芎嗪可上調(diào)KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨中miR-20b的表達(dá)水平，下調(diào)VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平，且高劑量川芎嗪的效果優(yōu)于低劑量川芎嗪和陽(yáng)性藥物塞來(lái)昔布[16-17]。因此本研究重點(diǎn)探索高劑量川芎嗪對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中上述相關(guān)基因表達(dá)的影響。

本研究結(jié)果顯示，大鼠關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶后，關(guān)節(jié)軟骨組織的Mankin’s評(píng)分較正常對(duì)照組顯著升高；而以川芎嗪干預(yù)處理后可降低關(guān)節(jié)軟骨組織的Mankin’s評(píng)分，減輕大鼠軟骨退變程度。RT-PCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠軟骨下骨組織中VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組均顯著升高，而B(niǎo)MP2、Smad1的mRNA和蛋白表達(dá)以及miR-20b表達(dá)水平均顯著降低；而以川芎嗪干預(yù)處理后大鼠軟骨下骨組織中VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達(dá)以及miR-20b表達(dá)水平均顯著升高。這表明在KOA發(fā)展過(guò)程中，大鼠軟骨下骨中的miR-20b/VEGF和BMP2/Smad1信號(hào)通路均發(fā)生了明顯改變，而川芎嗪可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。

VEGF是一個(gè)重要的促進(jìn)血管生成因子，可由破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，其過(guò)度表達(dá)可引起軟骨下骨血管異常新生，或者誘發(fā)軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)[18]。有研究顯示，在胚胎肢體發(fā)育過(guò)程中，可通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)肌肉來(lái)源干細(xì)胞向軟骨分化，進(jìn)一步促進(jìn)缺損軟骨的修復(fù)[19]。而部分miRNA則可通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)來(lái)激活關(guān)節(jié)局部炎性反應(yīng)以及血管再生，從而參與到OA的進(jìn)程中[20]。研究表明，miR-20b可通過(guò)靶向作用于缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），從而間接調(diào)控VEGF的表達(dá)[21]；可直接靶向作用于VEGF3′-非編碼區(qū)，從而抑制VEGF的表達(dá)[22]。這表明干預(yù)miR-20b/VEGF信號(hào)通路的表達(dá)將有助于調(diào)控軟骨下骨的血管生成及炎性反應(yīng)。結(jié)合前期研究結(jié)果表明，川芎嗪可能是通過(guò)上調(diào)軟骨及軟骨下骨中miR-20b表達(dá)，促進(jìn)VEGF mRNA降解，繼而抑制VEGF蛋白的表達(dá)，從而抑制血管侵入鈣化軟骨層，維持軟骨下骨及骨小梁的重塑平衡，并抑制新生血管蔓延至非鈣化軟骨，來(lái)發(fā)揮緩解炎性反應(yīng)和關(guān)節(jié)軟骨退變的作用。

BMP2是BMPs蛋白家族中的一員，可調(diào)節(jié)骨生成與吸收的平衡，在骨重塑過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；也可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮軟骨保護(hù)及修復(fù)的作用[23]。已有研究證實(shí)，BMP2可加快軟骨損傷后的軟骨修復(fù)進(jìn)程，減少纖維軟骨的形成從而改善軟骨基質(zhì)的外觀(guān)和構(gòu)成[24]；也有研究顯示，通過(guò)干預(yù)軟骨下骨BMPs相關(guān)蛋白的表達(dá)可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的再生修復(fù)[3]。而Smad1/5和Smad4對(duì)破骨細(xì)胞的分化有重要作用，其形成的BMP-Smad信號(hào)通路參與了骨重塑的過(guò)程[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，川芎嗪可上調(diào)OA大鼠軟骨下骨組織中BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)合前期研究結(jié)果表明，川芎嗪可能通過(guò)調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨BMP2/Smad信號(hào)通路從而調(diào)控軟骨下骨的骨重塑過(guò)程。

綜上所述，川芎嗪能修復(fù)KOA模型大鼠損傷的關(guān)節(jié)軟骨，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)軟骨及軟骨下骨中miR-20b表達(dá)，促進(jìn)VEGF mRNA降解繼而抑制VEGF蛋白的表達(dá)，同時(shí)激活BMP2/Smad1信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。但軟骨下骨與關(guān)節(jié)軟骨中miR-20b/VEGF和BMP2/Smad1信號(hào)通路之間是否存在相互調(diào)節(jié)的作用，而它們之間又是如何調(diào)控的？miR-20b是否通過(guò)靶向作用于VEGF來(lái)調(diào)控BMP2/Smad1信號(hào)通路的活性，從而影響軟骨下骨骨重塑的穩(wěn)態(tài)并進(jìn)一步調(diào)節(jié)軟骨修復(fù)？對(duì)以上問(wèn)題，本課題后續(xù)擬進(jìn)一步研究探索miR-20b/VEGF和BMP2/Smad1信號(hào)通路之間的調(diào)控關(guān)系，深入揭示川芎嗪臨床防治KOA的分子機(jī)制。

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（收稿日期：2018-08-29 修回日期：2019-01-02）

（編輯：段思怡）