劉利 郅軍銳 岳文波 謝文 張濤

摘 要：為明確西花薊馬體內(nèi)抗氧化酶基因FoCAT在適應不同寄主植物中的作用，利用實時熒光定量PCR技術測定了西花薊馬從菜豆豆莢分別轉換到菜豆植株和蠶豆植株后，F(xiàn)1、F2和F3代2齡若蟲和成蟲體內(nèi)FoCAT表達量的異同。結果表明：西花薊馬從菜豆豆莢轉換到菜豆植株和蠶豆植株后，除取食蠶豆植株的F2代成蟲體內(nèi)FoCAT表達量和取食豆莢的沒有明顯區(qū)別外，其余情況下都顯著降低。同一世代下FoCAT表達量在2齡若蟲與成蟲間差異較大。取食蠶豆植株的西花薊馬體內(nèi)FoCAT的表達量均顯著高于取食菜豆植株的。結果說明西花薊馬轉換到新的寄主后，F(xiàn)oCAT迅速產(chǎn)生響應，其表達量與寄主的嗜食性、自身的蟲態(tài)及取食的世代相關。

關鍵詞：西花薊馬;寄主轉換;繼代適應;過氧化氫酶;FoCAT

中圖分類號：S43

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）03-0022-05 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.005

Abstract：To clarify the response of FoCAT gene in Frankliniella occidentalis adaptability to host plants，quantitative real-time PCR was used to determine the expression levels of FoCAT in F. occidentalis 2nd instar nymphs and adults at F1，F(xiàn)2，and F3 generations after shifting to kidney bean and broad bean plants from kidney bean pod，respectively. The results showed that the expression levels of FoCAT in F. occidentalis significantly decreased after shifting except those adults at F2 generation when feeding on the broad bean. There were variations in the expression differences of FoCAT between 2nd instar nymphs and adults at the same generation. The expression levels of FoCAT in broad bean plant were higher than those in kidney bean plant. Our results indicated that FoCAT could respond quickly to host shift when F. occidentalis shifted to the new host，and its expression level was relative to host preference，thrips’ stage，and feeding generations.

Key words：Frankliniella occidentalis; host shift; subsequent adaptation; catalase; FoCAT

過氧化氫酶（CAT）是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，廣泛存在于動物、植物及微生物中[1]。CAT是清除H2O2最主要的酶，在維持機體內(nèi)氧化還原的平衡及保護機體免受傷害中起到重要的作用[2-3]。植食性昆蟲在受到逆境脅迫時，會導致機體內(nèi)活性氧大量積累，從而刺激抗氧化系統(tǒng)CAT等酶系的應答[4]。CAT被認為是植物次生物質(zhì)和殺蟲劑的新分子靶標[5]，植食性昆蟲取食寄主植物后，蟲體內(nèi)CAT活性發(fā)生明顯的變化以適應植物的組成抗性和誘導抗性對昆蟲的防御，維持機體內(nèi)氧化還原的平衡。如楊玉婷等[6]研究發(fā)現(xiàn)韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga幼蟲取食不同寄主后CAT的活性顯著升高。李會平等[7]研究表明，與取食感蟲楊樹相比，桑天牛幼蟲取食抗蟲楊樹后CAT活性明顯升高。劉建業(yè)等[8]也發(fā)現(xiàn)寄主植物是影響西花薊馬體內(nèi)CAT活性變化的主要原因。

西花薊馬Frankliniella occidentalis，是世界性的重要入侵害蟲[9-10]，通過取食、產(chǎn)卵和傳毒進行危害，給蔬菜及花卉的生產(chǎn)帶來重大損失[11]。西花薊馬寄主植物繁多，但對寄主的嗜食性不同，其在不同寄主上的生長發(fā)育、存活率及繁殖率均存在明顯差異[12-13]，且體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量和CAT等抗氧化酶活性以及解毒酶活性也不同，并隨適應代數(shù)發(fā)生變化[14-15]。菜豆和蠶豆均是西花薊馬的寄主，但西花薊馬對菜豆的嗜食性高于蠶豆，并且對菜豆豆莢的嗜食性高于菜豆葉片[16]。西花薊馬在寄主轉換過程中的適應性對其種群增長至關重要，本文研究了西花薊馬從菜豆豆莢分別轉換到菜豆植株和蠶豆植株繼代適應過程中2齡若蟲和成蟲體內(nèi)抗氧化酶基因FoCAT表達量的變化，以期闡明西花薊馬種群在不同嗜食寄主不同世代之間適應性的變化規(guī)律及不同蟲態(tài)適應性的異同，為進一步揭示西花薊馬對寄主的適應機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲：人工氣候箱中長期繼代飼養(yǎng)（20代以上）的西花薊馬菜豆豆莢種群。條件為溫度（25±1）℃，濕度（75±5）%，光周期14 h∶10 h（L∶D）。

供試植株：矮生菜豆Phaseolus vulgaris 品種：金束鹿泰國地豆王（河北省辛集市盛農(nóng)種子公司）。于人工氣候室內(nèi)種植菜豆植株，條件為溫度（25±1）℃，濕度（75±5）%，光周期14 h∶10 h（L∶D），每營養(yǎng)缽（直徑10 cm，高9 cm）培育兩株清潔苗，待菜豆長至3～4真葉時期，取長勢一致的菜豆植株作為供試寄主植物。蠶豆Vicia faba品種：臨蠶五號（康樂縣進忠農(nóng)產(chǎn)品實業(yè)開發(fā)有限責任公司）。培育條件同上，每營養(yǎng)缽培育四株清潔苗，待蠶豆長至約15 cm，葉片8～10葉時，取長勢一致的蠶豆植株作為供試寄主植物。生長期間均不施用任何農(nóng)藥。

1.2 方法

1.2.1 菜豆和蠶豆植株上不同世代西花薊馬的飼養(yǎng)及取樣

取菜豆豆莢上飼養(yǎng)并羽化3 d后已交配的西花薊馬雌成蟲轉換到菜豆植株上并飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲籠（86 cm×45 cm×41 cm）中，24 h后剔除所接所有成蟲，待西花薊馬若蟲發(fā)育至2齡時，每個養(yǎng)蟲籠取200頭2齡若蟲為一個樣，放入1.5 mL離心管中，記為菜豆F1代2齡若蟲。同時保留一定若蟲繼續(xù)在植株上飼養(yǎng)，至成蟲階段后取成蟲150頭放入1.5 mL離心管中，記為菜豆F1代成蟲，取樣后立即用液氮冷凍，然后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取F1代已交配的雌成蟲，依照F1代相同的方法轉換到新的菜豆植株上，待發(fā)育到2齡若蟲和成蟲后進行取樣，分別記為菜豆F2代2齡若蟲和菜豆F2代成蟲。按照以上方法繼續(xù)取菜豆F3代2齡若蟲和菜豆F3代成蟲。

蠶豆植株上飼養(yǎng)和取樣方法同上。每一個養(yǎng)蟲籠的薊馬為1個重復，設置5個重復。以菜豆豆莢上長期繼代飼養(yǎng)的西花薊馬2齡若蟲和成蟲為對照，記為CK。

1.2.2 RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

供試西花薊馬總RNA提取根據(jù)Eastep Super總RNA提取試劑盒（Promega公司）說明書進行。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，以NanoPhotometerTMP -Class分光光度儀測定RNA濃度。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo公司）說明書合成第一鏈cDNA，-20℃保存。

1.2.3 實時熒光定量（Realtime qPCR）分析

以西花薊馬EF-1作為內(nèi)參基因[17]，根據(jù)西花薊馬已克隆的過氧化氫酶基因FoCAT（GeneBank登錄號KX115435）設計引物，進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）。EF-1引物序列EF-1-F：TCAAGGAACTGCGTCGTGGAT;EF-1-R：ACAGGGGTGTAGCCGTTAGAG。FoCAT引物序列FoCAT-F：ACTTGGTTCCTGGTATTGAG;FoCAT-R：TGTTGGGATAGTAGTTGGGTG。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應在CFX96

？偩e

實時熒光定量PCR儀（Bio-rad公司）上進行。反應體系10 μL：5.0 μL FastStart Essential DNA Green Master（Roche公司），正反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，DEPC水3 μL。程序為：95℃預變性10 min，95℃變性30 s、60℃退火和延伸30 s，進行40個循環(huán)。每次生物重復進行3次重復。反應完成收集Ct值，分析溶解曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

結果采用2-ΔΔCt法[18]進行基因相對表達量的計算。用Excel 2016和SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，不同世代間西花薊馬體內(nèi)FoCAT的表達量差異性分析用Duncan氏多重比較，同一世代2齡若蟲和成蟲間、同一世代同一蟲態(tài)不同植株間FoCAT表達量的差異均采用獨立樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 轉換到菜豆植株上西花薊馬FoCAT表達量的變化

西花薊馬從菜豆豆莢轉換到菜豆植株后，不論哪個世代下的西花薊馬2齡若蟲和成蟲體內(nèi)FoCAT表達量都顯著降低（表1），但2齡若蟲和成蟲在不同世代下的變化不同。西花薊馬2齡若蟲體內(nèi)FoCAT表達量在不同世代間無顯著差異。對于成蟲而言，F(xiàn)2代FoCAT表達量最低，只有對照的3.72%，且顯著低于F1代和F3代。

同一世代下西花薊馬2齡若蟲和成蟲FoCAT表達量的差異不同。取食菜豆豆莢即對照下，2齡若蟲體內(nèi)FoCAT表達量顯著高于成蟲的，取食菜豆植株的F2代也如此。但在F1代兩蟲態(tài)間無顯著差異，F(xiàn)3代2齡若蟲表達量則顯著低于成蟲。

2.2 轉換到蠶豆植株上西花薊馬FoCAT表達量的變化

西花薊馬轉換到蠶豆植株后，西花薊馬2齡若蟲體內(nèi)FoCAT表達量明顯下降，F(xiàn)1、F2和F3代的表達量只有對照的46.20%、66.80%和51.77%，且F1表達量最低。轉換到蠶豆植株后成蟲體內(nèi)FoCAT表達量在F2代與對照無顯著差異，F(xiàn)1和F3代均顯著低于對照，分別為對照的43.47%和51.50%，且F1和F3代間差異不顯著。

同一世代下，除F2代2齡若蟲和成蟲體內(nèi)FoCAT表達量無顯著差異外，對照、F1代和F3代均是2齡若蟲體內(nèi)FoCAT表達量顯著高于成蟲。

2.3 西花薊馬取食菜豆植株和蠶豆植株同一世代下FoCAT表達量的差異

同一世代下，不論西花薊馬的2齡若蟲還是成蟲，蟲體內(nèi)FoCAT的表達量在取食菜豆植株和蠶豆植株后明顯不同。取食蠶豆植株的西花薊馬F1、F2和F3代2齡若蟲體內(nèi)的表達量均顯著高于取食菜豆植株的（P<0.05），依次是取食菜豆植株的3.90倍、4.55倍和5.26倍。取食蠶豆植株后西花薊馬成蟲體內(nèi)FoCAT的表達量也顯著高于取食菜豆植株的，F(xiàn)1、F2和F3代依次為取食菜豆植株的2.39倍、24.34倍和2.33倍（P<0.05）。

3 結論與討論

昆蟲在受到逆境脅迫后，體內(nèi)活性氧大量積累，導致機體受到傷害。CAT作為昆蟲抗氧化酶系的重要酶之一，在清除活性氧，維持體內(nèi)氧化自由基的平衡起到重要作用。本研究表明西花薊馬從最嗜食的菜豆豆莢轉換至菜豆植株和蠶豆植株后，無論哪個世代2齡若蟲體內(nèi)FoCAT的表達量均顯著降低，且在同一世代中，取食蠶豆植株的表達量都顯著高于取食菜豆植株的。說明菜豆植株和蠶豆植株兩種寄主植物對西花薊馬FoCAT的表達量有了顯著影響，且在嗜食度較高的菜豆植株上FoCAT表達量較低。這和劉建業(yè)等[8]研究相同CO2濃度下西花薊馬取食嗜食度較高的四季豆后CAT的活性較低，而取食嗜食性較差的茼蒿和辣椒活性較高的結果相似。但也有學者的結果與此相反，如楊玉婷等[6]研究發(fā)現(xiàn)韭菜遲眼蕈蚊在適應性較高的韭菜上蟲體內(nèi)保護酶的活性較高;張林林等[19]研究發(fā)現(xiàn)小地老虎取食最適宜寄主植物大豆后，蟲體內(nèi)CAT、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活性高于取食不適宜寄主。不同學者的研究結果不同可能與寄主植物種類有關，也與害蟲的種類有關。西花薊馬體內(nèi)FoCAT表達水平的差異可能與受害蠶豆植株的應激反應使得植物次生物質(zhì)和游離氨基酸等改變有關[20-21]，非嗜食的蠶豆植株促使西花薊馬體內(nèi)產(chǎn)生更多的活性氧，進而誘導FoCAT表達量升高以應對植物有毒次生物質(zhì)。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，飛蝗取食次生代謝物槲皮素后能顯著誘導其體內(nèi)CAT的轉錄水平升高。Agliassa和Maffei[23]也發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾Spodoptera littoralis可通過增加包括CAT在內(nèi)的抗氧化酶活性和基因表達量以應對牛至的萜類化合物。這種基因水平的差異也可能與寄主植物攜帶的抗性基因有關。郭同斌等[24]研究表明，楊小舟蛾Micromelalopha troglodyta幼蟲取食兩種轉基因楊樹葉片后，中腸CAT活力被顯著抑制。Mittapalli等[25]還表明，與易感小麥相比，抗性小麥上小麥黑森癭蚊Mayetiola destructor幼蟲的基因MdesCAT-1和MdesCAT-2的mRNA水平增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，取食蠶豆植株和菜豆植株后西花薊馬體內(nèi)FoCAT的表達量都顯著降低，這可能由于西花薊馬與寄主植物長期進化的結果，相對于離體的豆莢，完整植株被取食后更能被誘導產(chǎn)生防御相關物質(zhì)[26]，從而抑制基因的表達。也可能因為菜豆豆莢中含有多胺類既能促進昆蟲發(fā)育也能增強保護酶的物質(zhì)[27]。

本研究還表明西花薊馬轉換到菜豆植株和蠶豆植株后FoCAT的表達量在F1代便能迅速做出變化以適應不同寄主，周福才等[28]、朱經(jīng)云[29]和陳瑞芬[15]在揭示昆蟲適應寄主植物時都發(fā)現(xiàn)各種酶活性在F1代產(chǎn)生明顯變化，但趨于穩(wěn)定的時間不同。周福才等[28] 研究表明煙粉虱體內(nèi)的A-NA羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶活性一般在F2代基本穩(wěn)定;朱經(jīng)云[29]發(fā)現(xiàn)桃蚜在寄主轉換的過程中P450上調(diào)基因CYP6a14在7代之后基本達到穩(wěn)定水平，下調(diào)基因CYP6a13在6代之后穩(wěn)定;陳瑞芬[15]研究表明西花薊馬解毒酶活性在寄主轉換后在6代左右達到相對穩(wěn)定[15]。本研究發(fā)現(xiàn)無論西花薊馬2齡若蟲還是成蟲體內(nèi)FoCAT的表達量在F1與F3代間都無顯著差異，但不能說明FoCAT的表達量在F3代回到F1代的表達水平，因為本實驗只進行到F3代，以后世代的情況還不得而知，西花薊馬需要多少世代FoCAT的表達量才能達到穩(wěn)定還需要進一步研究。

本研究只測定了植株轉換過程中西花薊馬抗氧化酶基因FoCAT表達量的變化，然而昆蟲與植物的相互作用是一個非常復雜的過程，昆蟲體內(nèi)多個基因參與寄主適應性，并且不同基因之間需要相互協(xié)調(diào)，所以西花薊馬對寄主植物的適應還需要進一步深入的研究。

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