CRISPR/Cas9技術在非模式植物中的應用進展

白英俊 李國瑞 黃鳳蘭 李威

摘要：基因組編輯技術的出現(xiàn)對植物遺傳育種及作物性狀的改良產(chǎn)生了深遠意義。CRISPR/Cas（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat）是由成簇規(guī)律間隔短回文重復序列及其關聯(lián)蛋白組成的免疫系統(tǒng)，其作用是原核生物（40%細菌和90%古細菌）用來抵抗外源遺傳物質(zhì)（噬菌體和病毒）的入侵。該技術實現(xiàn)了對基因組中多個靶基因同時進行編輯，與前兩代基因編輯技術：鋅指核酶（ZFNs）和轉錄激活因子樣效應物核酶（TALENs）相比更加簡單、廉價、高效。目前CRISPR/Cas9基因編輯技術已在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、煙草（Nicotianabenthamiana）、水稻（Oryzasativa）、小麥（Triticumaestivum）、玉米（Zeamays）、番茄（tomato）等模式植物和多數(shù)大作物中實現(xiàn)了定點基因組編輯，其應用范圍不斷地向各類植物擴展。但與模式植物和一些大作物相比，CRISPR/Cas9基因編輯技術在非模式植物，尤其在一些小作物的應用中存在如載體構建、靶點設計、脫靶檢測、同源重組等問題有待進一步完善。該文對CRISPR/Cas9技術在非模式植物與小作物研究的最新研究進展進行了總結，討論了該技術目前在非模式植物、小作物應用的局限性，在此基礎上提出了相關改進策略，并對CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的研究前景進行了展望。

關鍵詞：CRISPR/Cas9系統(tǒng)，植物遺傳育種，基因組編輯，非模式植物

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）03-0419-08

遺傳突變對于研究植物基因功能和作物遺傳改良至關重要。在過去，自然突變體的表征已經(jīng)揭示了遺傳多樣性的重要性。而且，許多研究已經(jīng)使用了物理方法（γ輻射）、化學方法（甲磺酸乙酯）或生物方法（例如T-DNA/轉座子）導致點突變、缺失、重排和基因重組得到突變體。但隨機誘變會產(chǎn)生許多不希望的突變，以及大規(guī)模的篩查突變體不僅工作繁瑣且成本昂貴。序列特異性核酸酶（SSNs）的出現(xiàn)在基因定點誘變方面實現(xiàn)了突破。SSN可以誘導特定的雙鏈斷裂（DSBs）染色體位點，此核酸酶可以引起的兩種不同的DNA雙鏈修復機制：非同源末端連接（nonhomologousend-joining，NHEJ）和同源重組型修復（homology-directedrepair，HDR）。鋅指核酸酶（ZFNs）作為第一代SSNs（Bibikovaetal.，2002）被用于編輯植物基因組（Petolino，2015）。然而，ZFN結構難以操作且成本高昂，極大地阻礙了它們在各類植物當中的應用（Sanjanaetal.，2012）。之后TALEN的開發(fā)并在植物中應用（Boch&Bonas，2010），雖然在載體的構建及操作上比ZFN更容易但是使用TALEN仍然需要建造復雜的串聯(lián)在TAL蛋白中的重復結構域且成本仍然很高。

CRISPR技術的問世加速了基因編輯工程的進程，突破了前兩代基因編輯技術對每個靶基因確定不同的核酸酶的局限性（Sunetal.，2016;Eyquemetal.，2017;Svitashevetal.，2015）。相比與前兩代基因編輯技術，CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需要對每1個基因靶位點修飾合成1個靶標sgRNA（singleguideRNA），實現(xiàn)了對基因組精確定點編輯。除此之外CRISPR/Cas9還有系統(tǒng)操作簡單、花費成本低、編輯效率高等優(yōu)勢。目前該技術已在擬南芥、水稻、玉米（Wangetal.，2017;Kleinstiveretal.，2016）等模式植物中實現(xiàn)了精確的定點突變，且正在進一步向更多的植物中實現(xiàn)其應用價值。

1CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本組成結構

一個完整的CRISPR序列組件應該含有重復序列區(qū)（repeat）和間隔區(qū)（spacer）。間隔區(qū)的功能在于外源DNA序列的識別與俘獲（Demircietal.，2018）短而保守的重復序列區(qū)內(nèi)存在回文序列，可以形成發(fā)卡結構實現(xiàn)對外源基因的降解。序列的上游存在一個啟動CRISPR的前導區(qū)（Doudna&Charpentier，2014），破壞外源入侵基因時需要在前導區(qū)上游的Cas蛋白基因家族的共同作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因。最后CRISPR序列和Cas蛋白基因組合成一個高度保守的CRISPR/Cas9系統(tǒng)（Osakabe&Osakabe，2015;Petolino，2015）。

CRISPR系統(tǒng)分成3個類型：Type1、Type2、Type3。Type1型在細菌和古生菌中均有分布（Puchta&Fauser，2014），Type1型較其他兩型相比組成最為復雜，不僅有多個亞型還包含了多種Cas蛋白，最核心蛋白元件為Cas3蛋白，該蛋白是一個含有多結構域的蛋白，但每個結構域都有不同的功能，其主要功能是核酸酶和解旋酶;Type2型的核心蛋白是含有HNH和RuvC兩個核酸酶結構域的Cas9蛋白（Panetal.，2016）;其中HNH核酸酶結構域在CRISPR系統(tǒng)中可以加工產(chǎn)生crRNA，對外源基因的剪切、降解有著重要作用，目前運用最為廣泛操作最為簡單的就是Type2型CRISPR系統(tǒng)（Lander，2016）;Type3型系統(tǒng)存在于少數(shù)細菌和古細菌，Cas6和Cas10蛋白元件包含在該系統(tǒng)中，其主要功能是參與crRNA的加工和入侵DNA的降解。

2CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機理

Type2型CRISPR-Cas系統(tǒng)只需要三個組件，即Cas9、RNA（tracrRNA）、CRISPRRNA（crRNA）識別和定位該系統(tǒng)病原體的遺傳物質(zhì)通過三步過程，即獲得、表達和干擾（Uncklessetal.，2017;Shenetal.，2013）。第一階段俘獲外源DNA：當噬菌體和病毒入侵時，細菌的間隔序列將俘獲外源基因的一小片段DNA序列，外源基因與間隔序列識別的序列被稱為protospaceradjacentmotif（PAM位點：NGG，N為任意堿基）;第二階段crRNA的表達：將臨近PAM的間隔序列修飾加工并整合到自身CRISPR基因座中，轉錄為Crispr前體RNA（CrisprprecursorRNA，precrRNA），之后進一步形成crRNA（shortCRISPR-derivedRNA，crRNA）（Shenetal.，2014;Samantaetal.，2016）;第三階段靶向干擾：對外源基因的降解除了需要成熟的crRNA之外還需要一些特異性較好的小分子RNA（tracrRNA反式激活RNA）的幫助。crRNA與tracrRNA形成新的復合體RNA，在與Cas9蛋白經(jīng)sgRNA的引導在PAM位點處與外源DNA互補實現(xiàn)降解（Puchta，2017;Xieetal.，2015）。

3CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物、小作物當中的應用

通常情況下非模式植物是指生長周期相對較長、且基因組尚未得到透徹研究的植物。CRISPR/Cas9基因編輯技術通過對基因的移碼突變、片段刪除及基因修改等功能，成為了植物遺傳改良和分子設計的理想途徑。CRISPR/Cas9基因編輯技術在更多非模式植物當中的應該不僅提高了生物多樣性，而且對于開發(fā)更多植物的潛力有著重要意義。該技術已經(jīng)逐漸在很多非模式植物中實現(xiàn)了基因組定點編輯（表1）。

3.1糙葉山黃麻（Parasponia）屬于榆科的熱帶樹種，被稱為唯一可以與根瘤菌建立固氮內(nèi)生真菌的非豆科植物

Vanetal.（2018）通過使用擬南芥AtU6啟動子驅動sgRNA，其中Cas9蛋白用35s啟動子驅動，使CRISPR/Cas9介導誘變PanHK4、PanEIN2、PanNSP1和PanNSP2四個基因，發(fā)現(xiàn)PanNSP1和PanNSP2是根瘤形成的必要條件。

3.2楊樹（Populus）是楊屬植物，全屬有100多種

楊木除了用于制作家具、造紙和火柴之外可廣泛用于生態(tài)防護林、三北防護林、農(nóng)林防護林和工業(yè)用材林。楊樹做為道路綠化，園林景觀用也是一個非常優(yōu)秀的樹種。Elorriaga（2016）以pK2GW7為CRISPR/Cas9基因編輯載體定點突變LEAFY與AGAMOUS基因，發(fā)現(xiàn)該基因為楊樹誘導雄性、雌性的必要基因。

3.3地錢（Marchantiapolymorpha）是苔蘚類植物中分布最為廣泛的物種之一

Suganoetal.（2014）以生長素調(diào)控因子ARF1為靶基因，用U6-1的啟動子驅動sgRNA，以及35S啟動子驅動的含核定位信號的Cas9蛋白，實現(xiàn)了CRISPR/Cas9在地錢當中的應用。

3.4苜蓿是苜蓿屬（Medicago）植物的通稱，俗稱金花菜，是一種多年生開花植物

Mengetal.（2017）以pFGC5941為CRISPR/Cas9基因編輯載體，以苜蓿U6啟動子驅動特定sgRNA，35s啟動子驅動Cas9蛋白對蒺藜苜蓿的PDS基因進行定點敲除，并在T0代得到10.35%的純合敲除突變體，為苜蓿等豆科牧草的功能基因組學研究提供了新的研究工具。

3.5百脈根（Lotuscorniculatus），豆科，屬多年生草本植物

百脈根不僅可以作為飼料，還可以用于田地土壤的改良植物。Wangetal.（2016）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，對百脈根共生固氮SNF相關基因進行了編輯研究。

3.6甜橙（Citrussinensis），喬木，枝少刺或近于無刺

橙子中含量豐富的維生素C、P，有著能增加機體抵抗力的作用。Jia&Wang（2014）以pBI121為CRISPR/Cas9基因編輯載體，靶向編輯CsPDS基因，檢測突變頻率在3.2%～3.9%，為今后利用該技術進行柑橘的品種改良奠定了基礎。

3.7香蕉（Musaspp.）是一種重要的熱帶水果和糧食作物

胡春華等（2017）構建了以MaPDS為靶標基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA載體。該載體中的Cas9蛋白由PUbi啟動子驅動，而sgRNA由水稻來源的U6a驅動，成功的獲得了抗性植株。

3.8作為全球最重要的水果作物之一，葡萄（grape）具有巨大的經(jīng)濟價值

Renetal.（2016）以IdnDH為靶基因的pCACRISPR/Cas9二元載體。其中擬南芥U6啟動子（AtU6）驅動sgRNA，Cas9蛋白基因又以35s啟動子驅動。實現(xiàn)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在葡萄當中的應該最終獲得了轉基因植株。

3.9矮牽牛（Petunia），碧冬茄屬，茄科，正式名碧冬茄，多年生草本植物

廣泛用于花壇布置，花槽配置，景點擺設，窗臺點綴，家庭裝飾。Zhangetal.（2016a）以PGGE為載體，利用CRISPR/Cas9靶向編輯了類胡蘿卜素生物合成中的關鍵酶PDS基因，成功獲得了突變體植株。

4目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的局限性

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式作物和一些大作物中已經(jīng)得到了充分的利用，如擬南芥、玉米、水稻、小麥等。但是擴展到非模式植物尤其是一些其開發(fā)潛力巨大實用價值有待提高的小作物，如蓖麻、蕎麥、絲瓜、薺菜等，還存在著一定的局限性。

4.1非模式植物中CRISPR/Cas9載體構建問題

在進行CRISPR/Cas9系統(tǒng)的載體構建時，與非模式和小作物相比模式植物和大作物的研究較為透徹，可用其專屬啟動子驅動敲除載體。而大多數(shù)非模式植物尤其是小作物只能使用通用的強啟動子（擬南芥U6）來驅動CRISPR/Cas9-sgRNA（Fauseretal.，2014;Zhang&Zhou，2014;D′halluink&Ruiter，2013）。經(jīng)不斷的研究一些科研人員構建了一套可以作為雙子葉植物或單子葉作物的通用載體（Khatodiaetal.，2017）。這些通用的CRISPR/Cas9載體只需將物種進行單雙子葉的區(qū)分便可以進行基因編輯。但這些通用載體對植物的適應性及敲除效率是否優(yōu)于植物的專屬敲除載體，其結果有待驗證。

4.2CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的靶點設計問題

自CRISPR/Cas9系統(tǒng)開創(chuàng)到應用，衍生出了包括人、動物、植物在內(nèi)的在線和/或單機版共有20多種sgRNA設計軟件。如CRISPRDesign、CRISPR-P等軟件（Leietal.，2013）。按照操作平臺、選擇物種、輸入序列、參數(shù)設置、結果輸出等內(nèi)容，通過制定30多個評測指標來確定靶基因的靶點。但是這些設計軟件在智能涵蓋的大多數(shù)模式植物和大的經(jīng)濟作物，還有很大一部分非模式植物及小作物目前沒有相應的sgRNA設計軟件。相關研究人員不得不根據(jù)常規(guī)靶點設計原則：

（1）靶點序列長度18～22bp，一般選擇20bp;（2）選擇的靶點序列應盡量靠近起始密碼子。一般以第一個或第二個外顯子為最佳;（3）選擇特異性較好的靶點序列相，盡量避免重復序列、多聯(lián)A序列，多聯(lián)T序列;GC含量為40%～50%為最佳;（4）靶點5’端允許1～2bp的錯配，但應保障靶點堿基匹配數(shù)不小于18bp。

為了確保敲除位點的準確性，通過基因外顯子核苷酸序列找到PAM位點手動設計多個sgRNA。這為后期靶點檢測確定特異性好的sgRNA增加了工作量。

4.3CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的基因編輯效率與脫靶評估問題

對確定的靶點進行效率檢測和脫靶評估時模式植物除了用實驗方法外。如酶切法、SMART測序法、SSA報告載體活性檢測法、Sanger測序法等（Yangetal.，2013;Hendeletal.，2014;Yinetal.，2015）。以綜合各類脫靶檢測方法為基礎，衍生出了定量分析基因敲除效率的相關軟件，如CRISPR-GA（CRISPRGenomeAnalyzer，http：//54.80.152.219/）。目前非模式植物只能通過體外轉錄sgRNA及體外酶切靶點DNA片段反應通過與已知活性的標準sgRNA靶點進行比較來評價目標sgrna的特異性（Cradicketal.，2014;Sunetal.，2015）。此活性測定雖然不難但是過程較為繁瑣加上需做重復試驗來最終確定活性較高的sgRNA，耗時耗力。

4.4CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非植物中的重組效率問題

重組效率低是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式植物和在非模式植物的通病，常規(guī)CRISPR使用與核酸酶（最常見的是Cas9）偶聯(lián)的指導RNA（gRNA），其一起連接到特定的DNA堿基區(qū)域;然后核酸酶剪切雙螺旋（Wangetal.，2015）。細胞修復機制嘗試重新加入切割的DNA末端，但偶爾會插入或刪除一些堿基，這將使DNA代碼變成亂碼，并且可能誤敲除靶基因。為了修復點突變，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還必須引入具有正確堿基的“供體”DNA鏈，然后依靠稱為同源性定向修復（HDR）的第二種細胞機制。但是此修復模式依賴于細胞分裂狀態(tài)，細胞分裂差HDR的作用也就很差。

4.5CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的遺傳轉化問題

利用遺傳轉化得到轉基因植株，重點在于轉化效率。目前相關研究表明轉化效率與載體大小成反比。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中，通常Cas9蛋白原件大于5kb，所以遺傳轉化效率在一定程度會受到影響。雖然一些研究發(fā)現(xiàn)通過以連續(xù)轉化的方式（即首先得到hCas9轉基因植株，之后將卸載Cas9的小型sgRNA質(zhì)粒轉化至hCas9植株中）得到了與直接轉化CRISPR/Cas9同樣的突變體植株，但此方法多適用于以葉片為受體的遺傳轉化系統(tǒng)，且hCas9基因整合至植物基因組中有無毒害作用目前尚未可知（Lowderetal.，2015;Mikamietal.，2015）。

4.6單堿基基因編輯系統(tǒng)在非模式植物中的應用問題

CRISPR/Cas9單堿基編輯系統(tǒng)的應用實現(xiàn)了DNA雙鏈不發(fā)生斷裂的情況下，通過sgRNA靶向定位，利用胞嘧啶核苷脫氨酶進行堿基編輯（魏瑜等，2017）。這項技術的成功糾正效率為23%～35%。目前該系統(tǒng)已經(jīng)在模式植物中得到應用。此技術的不足之處在于，該系統(tǒng)只能實現(xiàn)單個堿基C→T或G→A的編輯。單堿基編輯系統(tǒng)的活性窗口仍然較大。單堿基編輯系統(tǒng)仍然會導致靶位點產(chǎn)生極少量DNA序列插入或缺失。

5提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的應用效率相關策略

5.1完善非模式植物全基因組測序

全基因組測序的目的是獲得物種的基因組序列，它可以研究基因組水平上物種的生長、發(fā)育、進化和起源加深對物種的了解，并在發(fā)現(xiàn)新基因和改進改良育種中發(fā)揮重要作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因組編輯研究，可以全面挖掘基因功能獲得重要的遺傳信息（Zhangetal.，2016b）。許多非模式植物，在各種極端生境中具有廣泛的生態(tài)適應性和生長能力，CRISPR/Cas9技術的應用將促進在極端生境中生長的一些特殊性狀基因的探索，如耐旱基因、耐鹽基因、耐冷基因等。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用加速了探索基因代謝途徑和轉錄調(diào)控機制，并可以通過基因敲除和插入突變，以實現(xiàn)對基因的改造。

5.2sgRNA和ssODNs的設計

在CRISPR/Cas9基因組編輯技術中，Cas9蛋白在特定靶位點上的裂解主要是由PAM序列和單鏈RNA（sgRNA）中的20nt序列決定的。因此，sgRNA序列的選擇具有靶向性，直接決定了Cas9蛋白核酸酶的定位位置。首先，必須有PAM序列，其中PAM序列是NGG（N是任意堿基）序列。其次，為了減少切割過程中Cas9蛋白的缺失率，sgRNA序列應該與基因組上的靶序列高度匹配（Cencicetal.，2014）。此外，sgRNA與基因組其它位點的同源性最差，否則很容易導致錯配。最后在設計sgRNA時將其長度從20nt縮短到17nt，有助于降低錯配幾率。

在CRISPR/Cas9基因組編輯技術中，sgRNA的設計和選擇非常重要。但在定點修改中，同源修復模板（ssODNS）的設計也是一個關鍵問題。兩種不同的DNA修復模式（HR和NHEJ）在雙鏈斷裂后被誘導。兩種DNA修復方法的區(qū)別在于HR需要1個同源修復模板，即短鏈DNA，即單鏈寡核苷酸（ssODNs）。使用該模板的HR可以進行精確的點突變、插入和敲除DNA。當在靶位點引入1個大片段DNA序列時，修復模板也可以是含有同源臂的1個雙鏈質(zhì)粒。近年來，ssODNs替代了雙鏈質(zhì)粒在基因組位點修飾中的應用。為了提高修復效率，ssODN包括和靶向序列互補的，分別沿著至少3′方向和5′方向延伸至少40nt的序列（Ranetal.，2013）。在此基礎上最好引入酶切位點，這樣就可以用限制性酶切多態(tài)性實驗（RFLP），很方便的檢測基因編輯系統(tǒng)是否有效。

5.3Cas9蛋白的改造

由于CRISPR/Cas9技術的發(fā)展，研究人員除了開發(fā)野生型SpCas9系統(tǒng)之外，還開發(fā)了新成員。在2015年，張峰團隊發(fā)現(xiàn)了一種更簡單的核酸酶（-Cpf1），它比Cas9更簡單它可以單獨完成crRNA的加工和成熟，而不依賴于核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA。-Cpf1不僅可以切割DNA序列，而且可以作用于RNA，并且沒有脫靶現(xiàn)象（Kimetal.，2016）。同年，張峰研究團隊還發(fā)現(xiàn)了1個新的蛋白質(zhì)C2C2，僅針對細菌中特定的RNA序列進行切割。這些新發(fā)現(xiàn)可以為研究者解決未來的問題提供便利。

6展望

CRISPR/Cas9技術自2013年問世以來，已經(jīng)迅速的普及到多種植物的遺傳育種當中，相對于前兩代TALENs＼＼ZFNs的基因編輯技術而言，敲除效率高、操作更加簡便、耗材少，適用于很多實驗室。在植物領域CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因組編輯主要應用于模式植物和部分大作物，但要實現(xiàn)技術的應用普及至更多的非模式植物和小作物中，在未來需要進一步改進和完善。（1）特異性基因的發(fā)掘。雖然目前許多模式植物，尤其是大作物的全基因組測序工作已經(jīng)完成。但是，很多非模式植物的基因組序列還尚未明確，許多關于重要性狀的基因還有待鑒定，一定程度上阻礙了CRSPR/Cas9技術在植物基因工程育種中的應用。（2）載體構建效率有待提高。目前在非模式植物中，sgRNA的設計主要通過研究人員對植物基因外顯子手動設計，且對sgRNA的特異性還要經(jīng)過試驗進一步驗證確定，嚴重影響后期的敲除效率，在沒有相關輔助軟件的情況下，費時費力。（3）非模式遺傳轉化體系的建立。目前，還有許多非模式植物由于沒有有效遺傳轉化體系難以應用CRISPR/Cas9基因編輯技術，加之該系統(tǒng)載體相對較大，對實現(xiàn)轉化效率也有一定的影響。（4）HDR發(fā)生頻率的提高。目前CRISPR/Cas9技術的研究主要是通過敲除靶位點，獲得轉基因植株。所以如何通過改造CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將HDR在基因組靶位點引入相關功能基因，將成為CRISPR/Cas9技術在植物基因工程改良工作中的重點突破方向。相信隨著CRISPR/Cas9技術的進一步發(fā)展這些問題終將被克服，它的出現(xiàn)必將給植物基因工程帶來更好的發(fā)展。

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