馬慧娟 徐慧 高宏

引言

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），也稱為綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬。廣泛分布于自然界（土壤、空氣、水源等）及正常人皮膚、腸道和呼吸道，大小為（1.5～3.0）μm×（0.5～0.8）μm，屬于非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌。該菌在普通培養(yǎng)基上生長良好，專性需氧，菌落形態(tài)不一，多數(shù)直徑在 2～3 mm，邊緣不整齊，扁平濕潤。在血瓊脂平板上形成透明溶血環(huán)。銅綠假單胞菌是一種重要的水源性致病菌，廣泛存在于各類型水中，對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有很強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。

目前檢測銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)中采用的主要是傳統(tǒng)生化方法，包括分離培養(yǎng)、生化鑒定等，不能實(shí)現(xiàn)大批量水樣的快速檢測。近幾年，隨著科技的發(fā)展，檢測銅綠假單胞菌的方法多種多樣，本文對近年銅綠假單胞菌檢測技術(shù)進(jìn)行綜述，為銅綠假單胞菌的快速、準(zhǔn)確檢測研究技術(shù)提供參考。

銅綠假單胞菌檢測技術(shù)

國標(biāo)濾膜法

檢測桶裝水中銅綠假單胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》。銅綠假單胞菌產(chǎn)色素分為三種：產(chǎn)綠膿菌素，產(chǎn)青膿素，產(chǎn)紅膿素;銅綠假單胞菌在4℃不生長而在42℃可以生長;具有氧化酶，可以使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物：可以產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，滴加納氏試劑（碘化汞鉀），氨在堿性條件下與碘化汞鉀作用，生成紅色絡(luò)合物;根據(jù)這些生化特性，通過濾膜過濾將銅綠假單胞菌富集到CN瓊脂上，再用生化試劑管進(jìn)行生化鑒定。也可以用VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)用于微生物鑒定，準(zhǔn)確率高，可用于微生物實(shí)驗(yàn)室的日常檢測工作。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

外毒素 A 基因在銅綠假單胞菌中高度保守，根據(jù) GenBank 中銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan探針，并利用實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)，對目標(biāo)靶序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，建立了一套檢測食品中銅綠假單胞菌的方法，特異性試驗(yàn)和靈敏性試驗(yàn)良好，該檢測方法具有特異、快速的特點(diǎn)，能夠滿足檢測要求，為食品中銅綠假單胞菌的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。

LAMP檢測

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（以下簡稱LAMP）：利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，40min內(nèi)可完成核酸擴(kuò)增，檢測過程不需要昂貴的儀器設(shè)備，簡單的水浴鍋即可，擴(kuò)增產(chǎn)物不需要繁瑣的電泳過程，快速靈敏，特異性強(qiáng)，成本低，尤其適合大量、即時(shí)、現(xiàn)場的病原微生物的初篩，易于在基層推廣應(yīng)用。

酶底物法

酶底物法（Pseudalert）采用特異性固定底物技術(shù)，目標(biāo)細(xì)菌產(chǎn)生能夠分解 Pseudalert 底物特定的酶，產(chǎn)生熒光，在24 h內(nèi)即可得到結(jié)果，無需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，該方法能夠較好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)濾膜法在檢測工作中的不足，在美國和歐洲部分地區(qū)已經(jīng)被批準(zhǔn)為檢驗(yàn)銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。

結(jié)論與展望

近年來瓶、桶裝水監(jiān)測發(fā)現(xiàn)各種污染物如銅綠假單胞菌等污染問題逐漸增多，因瓶、桶裝水中污染物如銅綠假單胞菌污染引起的食物中毒也時(shí)有發(fā)生，成為公共衛(wèi)生的重大隱患。國標(biāo)方法作為一種傳統(tǒng)、經(jīng)典的檢測方法，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法、LAMP方法、酶底物法一起成為食品安全檢測的重要工具。傳統(tǒng)方法假陽性率低，但檢測周期長。隨著技術(shù)研究的不斷深入，希望核酸方法、酶底物法能夠進(jìn)一步優(yōu)化和完善，實(shí)現(xiàn)快速、特異、靈敏、高通量，可廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、檢驗(yàn)檢疫、衛(wèi)生防疫、疾病診斷等領(lǐng)域，前景非常廣闊。